柔嫩艾美耳球蟲微線蛋白1(EtMIC1)的克隆表達(dá)及功能初步研究.pdf

1、雞球蟲病是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的一種寄生原蟲病，目前對于雞球蟲病采用的免疫控制技術(shù)得到越來越多的應(yīng)用。由于雞球蟲活卵囊疫苗完全以雞體作為唯一制苗載體，普遍存在著弊端。因此，雞球蟲病的可持續(xù)控制期待著新型疫苗的研究開發(fā)。柔嫩艾美耳球蟲微線蛋白1(micronemeprotein，MIC1)基因是Tomley等人對柔嫩艾美耳球蟲的大量的表達(dá)序列標(biāo)簽(ExpressedsequenetagsESTs)作分析后，鑒定出的微線蛋白基因，研究認(rèn)為其是參與

2、球蟲入侵宿主細(xì)胞過程中的一種重要蛋白，但是否能夠?qū)η蛳x產(chǎn)生免疫保護(hù)，以及其如何產(chǎn)生免疫應(yīng)答，目前尚無確切的研究數(shù)據(jù)。
　　 我們根據(jù)GeneBank上報(bào)道的MIC1基因序列，用RT-PCR技術(shù)克隆得到MIC1基因序列。然后應(yīng)用基因工程技術(shù)，將MIC1基因序列以及該序列中的MIC1粘附結(jié)構(gòu)域(MIC1-AD)分別克隆到原核表達(dá)載體pMAL-c2X中并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。SDS-PAGE電

3、泳顯示，表達(dá)的重組蛋白MIC1和MIC1-AD的分子量分別為116KDa左右和166KDa左右，與推導(dǎo)的氨基酸序列的大小相符。它們的IPTG誘導(dǎo)菌經(jīng)超聲波裂解破碎，SDS-PAGE結(jié)果表明，它們的大部分表達(dá)產(chǎn)物在裂解液上清中。按pMAL-c2X表達(dá)系統(tǒng)純化操作手冊，經(jīng)AmyloseResin層析獲得較高濃度的純化重組蛋白。
　　 將制備好的pMAL-c2X-MIC1、pMAL-c2X-MIC1-AD重組蛋白按所設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案于7

4、、14、21日齡分別二次經(jīng)胸部肌肉注射免疫嶺南黃雞。28日齡經(jīng)口感染3×104新鮮的E.tenella孢子化卵囊。35日齡撲殺實(shí)驗(yàn)雞，分別統(tǒng)計(jì)成活率、相對增重率等指標(biāo)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：2種重組蛋白均能降低卵囊產(chǎn)量，減輕盲腸病變，證實(shí)了MIC1-AD為MIC1的主要功能區(qū)域。其中，高劑量重組蛋白免疫效果優(yōu)于低劑量重組蛋白免疫效果。
　　 通過ELISA方法對免疫前、一免后、二免后、三免后及攻蟲后7d的動(dòng)物血清進(jìn)行抗體效價(jià)的測定，