不結(jié)球白菜BrCPK6基因的克隆及抗逆相關(guān)基因在擬南芥中的功能分析.pdf

1、干旱、鹽害、極端溫度、化學(xué)毒害和氧化脅迫等非生物脅迫嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn),并導(dǎo)致環(huán)境退化。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,需要對(duì)各種逆境信號(hào)作出反應(yīng),這就要求對(duì)各種功能基因的表達(dá)進(jìn)行精確調(diào)控。因此,系統(tǒng)研究植物對(duì)環(huán)境脅迫應(yīng)答的機(jī)制就顯得尤為重要。
　　 利用PCR技術(shù)從不結(jié)球白菜cDNA文庫(kù)中克隆到1個(gè)新的編碼鈣依賴(lài)型蛋白激酶(CDPK)的全長(zhǎng)cDNA序列,命名為BrCPK6。BrCPK6基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)為1,638bp,編碼一個(gè)由

2、545個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。推導(dǎo)的氨基酸序列與蕓薹屬已知的CDPK類(lèi)蛋白激酶的同源性可達(dá)90％以上,與擬南芥AtCPK6的同源性達(dá)89％。使用Real-Time PCR技術(shù)對(duì)BrCPK6基因在不同組織以及不同逆境脅迫下的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了定量分析,結(jié)果表明,BrCPK6基因的表達(dá)在根中最高,并且受鹽、低溫和ABA的誘導(dǎo)。
　　 利用轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)株系和突變體材料研究了一個(gè)鈣依賴(lài)型蛋白激酶AtCPK6在擬南芥中的功能。Real-T

3、ime PCR技術(shù)對(duì)AtCPK6基因在不同逆境脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析表明,AtCPK6基因的表達(dá)受鹽、干旱脅迫的誘導(dǎo)。在鹽、干旱脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)株系的存活率顯著高于野生型,滲透保護(hù)物質(zhì)脯氨酸含量顯著提高,質(zhì)膜過(guò)氧化副產(chǎn)物丙二醛含量顯著降低。對(duì)脅迫應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析表明,一些基因(如Rd29A等)的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)株系中顯著上調(diào)。但突變體材料沒(méi)有表現(xiàn)出與野生型的明顯差異。由此說(shuō)明,AtCPK6基因可能作為脅迫信號(hào)

4、轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個(gè)“節(jié)點(diǎn)”,與CDPK家族的其它成員一起參與植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)。
　　 利用PCR方法和基于PCR的PTDS方法(PCR—based two-step DNA synthesis,PTDS)分別合成了來(lái)源于酵母的轉(zhuǎn)錄因子ACE1基因和來(lái)源于藍(lán)細(xì)菌的金屬硫蛋白SmtA基因,并利用模式植物擬南芥研究了上述兩個(gè)基因的功能。分析其在重金屬脅迫條件下的功能表明,在銅離子脅迫條件下,過(guò)量表達(dá)ACE1基因的擬南芥存活率較野生

5、型顯著提高,并避免了兩個(gè)關(guān)鍵的葉綠素生物合成酶在銅離子脅迫下的降解,同時(shí)由于活性氧清除酶系統(tǒng)的啟動(dòng),SOD和POD的活性顯著增強(qiáng),因此減小了由銅離子脅迫產(chǎn)生的ROS對(duì)細(xì)胞造成的傷害,從而提高了植株對(duì)銅離子的耐受性；金屬硫蛋白SmtA與鋅離子有很強(qiáng)的親和力,過(guò)量表達(dá)SmtA基因的擬南芥存活率較野生型顯著提高,并通過(guò)激活活性氧清除酶系統(tǒng),增強(qiáng)了SOD和POD的活性,因此減小了高鋅脅迫產(chǎn)生的ROS對(duì)植物細(xì)胞造成的損傷,從而提高了植株對(duì)鋅脅迫的