北京地區(qū)犬細(xì)小病毒病的分子流行病學(xué)調(diào)查研究.pdf

1、近年來(lái),隨著我國(guó)寵物群體的迅速擴(kuò)大,寵物病嚴(yán)重威脅著該群體的健康,對(duì)行業(yè)造成了巨大的損失。犬細(xì)小病毒病為一種烈性傳染病,通常發(fā)病率為50％～100％,死亡率為10％～50％,是犬群危害性最大的疾病之一。該病病原為犬細(xì)小病毒(CPV),過(guò)去的三十年中,CPV進(jìn)化較快,在DNA病毒中比較少見(jiàn)。而目前使用的商品化疫苗保護(hù)力下降,常出現(xiàn)免疫失敗,因此,本研究對(duì)2010～2011年北京市犬細(xì)小病毒病的分子流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查及遺傳差異分析,對(duì)今后研究

2、CPV的抗原變異以及開發(fā)更有效的疫苗具有十分重要的指導(dǎo)意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)建立了快速檢測(cè)CPV的PCR方法,最低能檢測(cè)出38.4 pg／mL的病毒DNA。隨機(jī)采集2010～2011年來(lái)自北京不同地區(qū)的327個(gè)臨床樣品(糞便、尿液、唾液、口鼻分泌物、血清等),應(yīng)用已建立的PCR檢測(cè)方法,共篩選出51個(gè)CPV陽(yáng)性樣品,檢出率為15.6％,膠體金免疫層析法檢測(cè)陽(yáng)性率為12.2％,可見(jiàn)PCR方法檢測(cè)CPV具有更高的靈敏性。
　　

3、 VP2作為CPV核衣殼蛋白的主要編碼基因,它包含結(jié)構(gòu)蛋白所有的中和抗原位點(diǎn),因此選擇VP2基因作為犬細(xì)小病毒病分子流行病學(xué)調(diào)查的靶基因。通過(guò)對(duì)51個(gè)陽(yáng)性樣品的VP2全長(zhǎng)基因的克隆及序列分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),樣品與參考毒株的核苷酸序列、氨基酸序列的同源性分別是98.2％～100％和97.7～100％。樣品之間核苷酸、氨基酸的同源性分別為99.0％～100％和98.8～100％,表明北京地區(qū)2010年以來(lái)的VP2基因變異較少。亞型分析表明CPV

4、主要基因型仍是CPV-2a,占90.2％(46／51),CPV-2b的比例很低,占9.8％(5／51),未發(fā)現(xiàn)CPV-2c和CPV-2。與經(jīng)典的CPV-2a／b參考株相比,北京流行株VP2基因主要以散發(fā)的點(diǎn)突變?yōu)樨S,包括555I1e→Val、324Tyr→Ile、267Phe→Tyr、440Thr→Ala、101Thr→Ile、87Leu→Met和139Val→Ile,個(gè)別樣本分別在187(Pro→Ile、Gln)、188(Ala→Gl

5、n)、308(Val→Ile)位發(fā)生置換。DNAStar分析顯示,除了Ile101、Ile139、Ile187、Gln187、Gln188、Tyr267位突變的意義不大以外,Met87、Ile308、Ile324、Ala440、Val555均處于VP2蛋白潛在抗原表位區(qū)域,因此其變異具有非常重要的生物學(xué)意義。遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示,51例樣品的VP2序列均處于CPV分支,不與FPV在同一分支。在CPV分支中,與臺(tái)灣、北京、武漢、南京分離

6、株的親緣關(guān)系較近,與巴西、法國(guó)、日本及越南,美國(guó)、意大利、波蘭分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　 按照氨基酸同源性分析,將同源性100％的樣品歸為一組,51個(gè)樣品可分為6組,分別取各組代表A1、B4、B6、B8、B25、E4共6份糞便樣品,通過(guò)同步培養(yǎng)法感染胎貓腎細(xì)胞F81,結(jié)果成功分離到5株病毒株,對(duì)分離的病毒進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、PCR檢測(cè)、IFA試驗(yàn)及TCID50檢測(cè),證實(shí)分離毒株為CPV。將分離的5株毒株分別命名為CPV-BJ-A1、