脫氧核酶對(duì)鴨甲肝病毒IRES元件的靶向抑制作用研究.pdf

1、為尋找基因水平治療鴨甲肝病毒(DHAV)的可行性靶位點(diǎn)，我們對(duì)DHAV的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(Internal Ribosome Entry Site，IRES)元件設(shè)計(jì)合成了6條（DZ369、DZ454、DZ514、DZ454-7、DZ454-9和DZ000）脫氧核酶(DNAzyme)，開(kāi)展了DNAzyme對(duì)IRES元件切割、對(duì)DHAV復(fù)制的抑制作用研究，獲得如下結(jié)果。
　　以構(gòu)建的pGEM-T/IRES質(zhì)粒為模板，通過(guò)T7體

2、外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到含有IRES結(jié)構(gòu)元件的RNA單鏈產(chǎn)物（DHAV-RNA），長(zhǎng)度約為361nt，在金屬離子Mg2+存在的情況下，DHAV-RNA與DNAzyme進(jìn)行相互作用后5.0％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示具有完整的酶切活性中心和與底物完全互補(bǔ)配對(duì)的側(cè)翼結(jié)構(gòu)的DZ369、DZ454和DZ514均能在靶RNA的G-C或者A-C位點(diǎn)進(jìn)行切割反應(yīng)，而只有完整酶切活性中心不具備切割底物的識(shí)別結(jié)構(gòu)域的無(wú)關(guān)對(duì)照組DZ000，不能對(duì)

3、靶RNA進(jìn)行有效切割，表明DNAzyme對(duì)IRES的切割反應(yīng)具有很強(qiáng)的特異性。
　　DNAzymes需要二價(jià)金屬離子的輔助才能更好地發(fā)揮作用，并且在不同金屬離子的作用下，DNAzymes對(duì)IRES表現(xiàn)出不同的切割活性，其中Mg2+對(duì)DNAzymes的活性表現(xiàn)出最強(qiáng)的促進(jìn)作用，其余依次是Zn2+、Mn2+、Ni2+和Co2+。
　　將含有IRES結(jié)構(gòu)元件的目的基因和Red基因克隆到pEGFP-N1中，得到雙表達(dá)載體pEGFP-

4、Red-IRES-N1并轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞中，成功表達(dá)出Red和EGFP熒光蛋白。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，重組克隆載體的綠色熒光蛋白的表達(dá)量只能到達(dá)對(duì)照組的60-65％，且IRES依賴性的EGFP開(kāi)始表達(dá)的時(shí)間比帽子依賴性的時(shí)間更延后，說(shuō)明IRES能起始其下游基因的表達(dá)，但是活性沒(méi)有CMV啟動(dòng)子的強(qiáng)。
　　隨后將雙表達(dá)載體pEGFP-Red-IRES-N1和DNAzyme共轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染DNAzyme的試驗(yàn)組中EGFP表達(dá)受到了抑

5、制，最強(qiáng)抑制作用出現(xiàn)在10μmol/L的DZ454組，而DNAzyme側(cè)翼長(zhǎng)度的改變沒(méi)有影響其活性。與對(duì)照組相比Red蛋白的表達(dá)量沒(méi)有差異，表明IRES起始的蛋白的表達(dá)是相對(duì)獨(dú)立的。
　　另外一個(gè)重要的結(jié)果是在DZ454對(duì)DHAV-1全病毒復(fù)制的抑制作用的試驗(yàn)中，用一步熒光定量RT-PCR(FQRT-PCR)的方法檢測(cè)細(xì)胞碎片中不同時(shí)間點(diǎn)3D基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，到第60 h時(shí)病毒的復(fù)制量達(dá)到最大值，之后保持不變，且在病毒復(fù)制