小菜蛾腺苷受體基因PxAdoR在N6(2-羥乙基)腺苷殺蟲過程中的作用研究.pdf

1、利用蟲生真菌或其毒力因子來防治害蟲是害蟲生物防治研究的熱點(diǎn)之一，關(guān)鍵問題是要揭示病原真菌的毒力因子如何作用于昆蟲。蟬花蟲草（Isaria cicadae Mique），其代謝產(chǎn)物N6(2-羥乙基)腺苷[N6-(2–hydroxyethyl)-adenosine，HEA]對(duì)小菜蛾具有一定的殺蟲活性，表現(xiàn)為蟬花蟲草分生孢子寄生小菜蛾類似的拒食，發(fā)育遲緩和致死等現(xiàn)象。本文利用前期抑制性消減雜交法得到的差異表達(dá)片段設(shè)計(jì)特異性引物，克隆小菜蛾腺苷

2、受體（Plutella xylostella adenosine receptor，PxAdoR）基因。并根據(jù)克隆得到的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異性引物合成含有目的基因片段的dsRNA進(jìn)行RNAi，通過熒光定量PCR分析HEA對(duì)PxAdoR基因相對(duì)表達(dá)量的影響。利用HEA及哺乳動(dòng)物腺苷受體A2aR抑制劑SCH58261處理小菜蛾2齡幼蟲結(jié)合RNAi技術(shù)研究HEA與PxAdoR受體之間的作用關(guān)系。主要結(jié)果如下：
　　1.腺苷受體基因PxAdo

3、R克隆及特征分析
　　利用HEA作用于小菜蛾獲得差異表達(dá)的片段設(shè)計(jì)特異性引物，采用RT–PCR和RACE技術(shù)從小菜蛾中克隆全長(zhǎng)1828 bp的小菜蛾腺苷受體基因，并通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)和分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),顯示其蛋白分子量為49.2 kDa，沒有信號(hào)肽，疏水性不穩(wěn)定蛋白，并且具有7次跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的一類G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPCRs)。并通過NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn)與哺乳動(dòng)物的腺苷受體存在差異

4、與昆蟲腺苷受體更相似。
　　2. HEA激活PxAdoR對(duì)小菜蛾致死率和體重增長(zhǎng)的影響
　　根據(jù)克隆得到的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異性引物合成含有目的基因片段的dsRNA，通過喂食的方法導(dǎo)入小菜蛾二齡幼蟲體內(nèi)，起到抑制目的基因PxAdoR表達(dá)的作用，再通過1 mg/ml的HEA連續(xù)喂食60 h，并取樣通過熒光定量PCR檢測(cè)經(jīng)過HEA處理后PxAdoR相對(duì)表達(dá)量情況。結(jié)果表明：HEA處理后PxAdoR基因的表達(dá)量與對(duì)照組有極顯著差異，比

5、對(duì)照組高了4.3倍，而通過喂食dsRNA后再經(jīng)過HEA處理的小菜蛾與CK組比有顯著的升高，但比HEA組低。表明HEA能有效激活PxAdoR基因的表達(dá)。
　　1 mg/ml的HEA對(duì)小菜蛾二齡幼蟲具有明顯的致死性，而施加包含目的基因的雙鏈RAN（PxAdoR–dsRNA）或喂食腺苷受體抑制劑SCH58261在36，48,60h能明顯降低HEA對(duì)小菜蛾幼蟲的死亡率和體重增長(zhǎng)抑制率。特別是在48 h處，喂食雙鏈RNA的RNAi干擾組的體