腺苷A2A受體在腦撞擊傷急性期的作用及機(jī)制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumaticbraininjury,TBI)死亡率、致殘率高，在現(xiàn)代社會(huì)中嚴(yán)重威脅人類生命及生活質(zhì)量。 創(chuàng)傷性顱腦損傷分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩方面。原發(fā)性損傷包括顱骨骨折、顱內(nèi)出血等，對(duì)于這些損傷目前已可經(jīng)過(guò)外科手術(shù)得到較好的解決。繼發(fā)性損傷則包括興奮性毒性損傷、過(guò)度炎性反應(yīng)和氧自由基損傷等，這些損傷因素嚴(yán)重影響著病人的預(yù)后，針對(duì)這些繼發(fā)性損害的治療措施，一直是研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。 腺苷廣泛存在于各

2、種組織的細(xì)胞外液。在包括創(chuàng)傷性顱腦損傷在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)損傷中，由于ATP的大量崩解，腦內(nèi)腺苷濃度會(huì)大幅度升高。A2A受體為四種腺苷受體之一，在多種神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型中，激活A(yù)2A受體既可產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，又可加重組織損傷，對(duì)這些矛盾效應(yīng)的機(jī)制目前尚不明確，而在急性創(chuàng)傷性顱腦損傷中A2A受體發(fā)揮何種效應(yīng)也尚無(wú)定論。本研究的目的既是對(duì)在急性創(chuàng)傷性顱腦損傷中A2A受體發(fā)揮何種作用進(jìn)行觀察，并對(duì)其復(fù)雜效應(yīng)的可能機(jī)制進(jìn)行探討，以期為臨床治療中合理

3、使用A2A受體調(diào)節(jié)藥物提供理論依據(jù)。 一、通過(guò)藥理學(xué)干預(yù)觀察A2A受體在腦撞擊傷急性期的作用 咖啡因?yàn)橐环N非選擇性的腺苷受體拮抗劑，但在低劑量時(shí)，主要對(duì)A2A受體起作用。CGS21680則是一種高選擇性的A2A受體激動(dòng)劑。本實(shí)驗(yàn)采用上述兩種藥物對(duì)小鼠進(jìn)行干預(yù)，對(duì)A2A受體在腦撞擊傷急性期的作用進(jìn)行研究。 方法 成年昆明白小鼠，隨機(jī)分為四個(gè)處理組：1、無(wú)藥物干預(yù)組；2、慢性咖啡因干預(yù)組：小鼠自出生后35-4

4、0d在飲水中加入0.25g/L咖啡因，連續(xù)飲用3w后用于實(shí)驗(yàn)；3、急性咖啡因干預(yù)組：致傷前30min腹腔給予咖啡因15mg/kg；4、急性CGS21680干預(yù)組：致傷前30min腹腔給予CGS216800.1mg/kg。每個(gè)處理組又包括對(duì)照組及急性腦撞擊傷組。腦撞擊傷模型采用自由落體法建立，使用20g重物自50cm高度墜落撞擊致傷。在傷后12h用高校液相法測(cè)定腦脊液中谷氨酸含量、定量PCR法測(cè)定損傷周圍腦組織炎性因子腫瘤壞死因子-α(t

5、umornecrosisfactor-α,TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的mRNA表達(dá)變化。在傷后24小時(shí)進(jìn)行小鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分，此后HE染色觀察腦組織病理變化，并用干濕重法測(cè)定損傷側(cè)大腦皮層腦組織含水量。 主要結(jié)果 1.急性給予A2A受體拮抗劑咖啡因和激動(dòng)劑CGS21680對(duì)腦撞擊傷后24小時(shí)神經(jīng)功能缺損程度和傷側(cè)大腦皮層含水量無(wú)明顯影響(P＞0.05)。但慢性給予咖啡因干預(yù)

6、，可明顯降低腦撞擊傷后24小時(shí)腦組織含水量(P＜0.01)，改善神經(jīng)功能缺損程度(P＜0.01)。 2.急性給予咖啡因和CGS21680干預(yù)對(duì)傷后12小時(shí)小鼠腦脊液中谷氨酸含量水平無(wú)明顯影響(P＞0.05)；而慢性給予咖啡因干預(yù)則可顯著降低傷后12小時(shí)腦脊液中谷氨酸水平(P＜0.01)。 3.與無(wú)藥物干預(yù)組比較，急性給予咖啡因和CGS21680干預(yù)的小鼠在腦撞擊傷后12小時(shí)傷側(cè)腦組織炎性因子TNF-α，IL-1β的mRN

7、A表達(dá)較對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而給予咖啡因慢性干預(yù)的小鼠炎性因子表達(dá)則較無(wú)藥物處理組明顯升高(P＜0.05)。 討論 腺苷A2A受體主要偶聯(lián)于Gs蛋白，活化后引起胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷濃度升高，促進(jìn)鈣離子內(nèi)流。在神經(jīng)系統(tǒng)，可以促進(jìn)突觸前膜釋放谷氨酸，但在炎性反應(yīng)調(diào)控中存在抑炎和促炎兩種調(diào)控方向。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在急性腦撞擊傷中，持續(xù)給予A2A受體拮抗劑——咖啡因具有抑制興奮性遞質(zhì)谷氨酸釋放和促炎的雙重效應(yīng)，但可

8、顯著降低腦撞擊傷急性期的神經(jīng)損傷，其原因可能是由于拮抗興奮性遞質(zhì)釋放的保護(hù)效應(yīng)超過(guò)了促炎的損傷作用。 二、利用A2A受體基因敲除小鼠觀察A2A受體在腦撞擊傷急性期的作用 為避免由于咖啡因和CGS21680的藥理局限性給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)的可能影響，在本部分實(shí)驗(yàn)中采用A2A受體基因敲除小鼠進(jìn)一步觀察A2A受體在腦撞擊傷急性期的作用。方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用成年A2A受體基因敲除純合子小鼠及其同胞的野生型小鼠。A2A受體基因敲除

9、小鼠及野生型小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組，腦撞擊傷組。在傷后6h、12h和24h3個(gè)時(shí)相點(diǎn)抽取小鼠腦脊液，高效液相色譜法測(cè)定腦脊液中谷氨酸濃度，并提取傷側(cè)腦組織RNA，定量PCR法檢測(cè)炎性因子TNF-α，IL-1β的mRNA表達(dá)變化；此外，在傷后24小時(shí)還對(duì)小鼠傷后神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦組織含水量和病理變化情況進(jìn)行觀察。 主要結(jié)果 1.基因敲除A2A受體可明顯降低腦撞擊傷后24h腦組織含水量(P＜0.01)，改善神經(jīng)功能缺損程

10、度(P＜0.01)。 2.基因敲除A2A受體小鼠(KO)在傷后6h腦脊液谷氨酸水平達(dá)高峰，此后明顯下降。野生型小鼠(WT)傷后6h腦脊液谷氨酸水平同樣明顯高于對(duì)照組，但是在12h進(jìn)一步升高，24h才開(kāi)始回落。 3.腦撞擊傷后12h，KO小鼠傷側(cè)腦組織炎性因子TNF-α，IL-1β的mRNA表達(dá)明顯高于野生型小鼠。傷后24h兩組小鼠傷側(cè)腦組織炎性因子表達(dá)無(wú)顯著差異。 討論 利用A2A受體基因敲除小鼠觀察A2

11、A受體在腦撞擊傷中的效應(yīng)，可以有效避免因拮抗劑選擇性不夠產(chǎn)生的影響作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基因敲除A2A受體可以抑制傷后谷氨酸的釋放；對(duì)炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)效應(yīng)則在病程不同階段發(fā)生變化：在早期(12h)對(duì)炎性因子表達(dá)有促進(jìn)作用，但24h時(shí)促炎效應(yīng)減退。由于敲除A2A受體在腦撞擊傷急性期的最終效應(yīng)是降低腦水腫，減輕神經(jīng)損傷，因此，在腦撞擊傷急性期，抑制A2A受體活性可能以減少谷氨酸釋放的作用為主，并因此產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。 三、谷氨酸對(duì)小膠

12、質(zhì)細(xì)胞A2A受體調(diào)控一氧化氮合酶活力作用的影響 A2A受體在神經(jīng)體統(tǒng)中對(duì)炎性反應(yīng)具有雙重的調(diào)控效應(yīng)。但這一雙重效應(yīng)的機(jī)制尚不清楚。谷氨酸釋放增加是神經(jīng)系統(tǒng)損傷中普遍存在的病理過(guò)程。其濃度變化有可能影響A2A受體在炎性反應(yīng)中的調(diào)控方向。 方法 使用出生后1-3天的C57BL/6野生型小鼠大腦皮層組織原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞分為如下幾組： 1.空白對(duì)照組：?jiǎn)渭兗尤牒?0％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基；

13、 2.LPS組：加入LPS1000ng/ml進(jìn)行刺激； 3.LPS+CGS21680組：在加入LPS的同時(shí)加入100nM的CGS21680進(jìn)行干預(yù) 4.LPS+CGS21680+谷氨酸組：同時(shí)分別給予0.1mM、0.25mM、0.5mM谷氨酸及與前述相同劑量的LPS和CGS21680； 5.LPS+谷氨酸組：在給1000ng/ml的LPS同時(shí)分別給予0.1mM、0.25mM、0.5mM谷氨酸。 主要結(jié)

14、果 1.LPS刺激可誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞中總NOS活力及iNOS活力明顯增高，給予A2A受體選擇性激動(dòng)劑CGS21680激活A(yù)2A受體會(huì)對(duì)該反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。 2.同時(shí)加入不同濃度谷氨酸時(shí)，CGS21680的作用根據(jù)谷氨酸濃度的不同而發(fā)生變化，在較低濃度谷氨酸存在時(shí)，CGS21680仍保持了抑制NOS生成的作用，但是在較高濃度的谷氨酸和A2A受體激動(dòng)劑同時(shí)存在時(shí)，A2A受體激動(dòng)劑抑制NOS活性的作用被逆轉(zhuǎn)，使NOS活力反而較L

15、PS組更為增高。 3.僅加入高濃度谷氨酸，NOS活力低于同時(shí)加入CGS21680組。 討論 本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在神經(jīng)系統(tǒng)中，A2A受體對(duì)炎性反應(yīng)的調(diào)控方向可能會(huì)受到谷氨酸濃度的影響，高濃度谷氨酸可以使該受體的抑炎效應(yīng)向促炎方向轉(zhuǎn)化，這有可能是A2A受體在神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)調(diào)控中矛盾作用的原因之一。 結(jié)論 一、慢性低劑量咖啡因干預(yù)可以有效減輕中度腦撞擊傷急性期神經(jīng)損傷。其主要原因?yàn)槁燥嬘每Х纫?，?/p>

16、效抑制了腦撞擊傷后谷氨酸的釋放，減少了谷氨酸的興奮性毒性損傷。 二、基因敲除小鼠可有效降低中度腦撞擊傷急性期神經(jīng)功能缺損，降低腦水腫，具有神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。敲除A2A受體明顯抑制腦撞擊傷后谷氨酸的釋放。A2A受體活化在中度腦撞擊傷早期具有抑炎作用，其后抑炎效應(yīng)減退。 三、激活A(yù)2A受體可以抑制活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中NOS活力的增高，但當(dāng)有高濃度谷氨酸存在時(shí)，這一抑制作用被逆轉(zhuǎn)，反而產(chǎn)生促進(jìn)NOS活力增高的作用。因此，谷氨酸濃度水