小麥TaNAC29和TaNAC2D基因克隆及抗逆功能研究.pdf

1、植物經(jīng)常受到干旱、高鹽以及極端溫度等各種不利環(huán)境因素的影響，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生重大負(fù)面效應(yīng)。當(dāng)植物處于這些不利環(huán)境條件時(shí)，其體內(nèi)許多相關(guān)基因會(huì)誘導(dǎo)表達(dá)。其中，轉(zhuǎn)錄因子就是這些重要基因中的一類。在轉(zhuǎn)錄因子家族中，NAC（NAM，ATAF與CUC）轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與其相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合，作為分子開(kāi)關(guān)調(diào)控基因的時(shí)空表達(dá)。近年來(lái)，關(guān)于NAC轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、衰老以及響應(yīng)非生物脅迫等方面的研究越來(lái)越多，但小麥作物中有關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能

2、分析還鮮有報(bào)道。本文以小麥NAC轉(zhuǎn)錄因子為研究對(duì)象，首先從普通小麥中國(guó)春基因組中鑒定、分離出10個(gè)TaNAC基因，在此基礎(chǔ)上重點(diǎn)研究了TaNAC29和TaNAC2D兩個(gè)基因的生物學(xué)功能。主要的研究結(jié)果如下：
　　1）通過(guò)小麥EST數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，我們成功拼接并克隆得到了10個(gè)小麥TaNAC基因，其中有9個(gè)為新鑒定的TaNAC基因。
　　2）序列比對(duì)表明，新基因TaNAC29定位于小麥2BS染色體。TaNAC29蛋白定位于小麥原生

3、質(zhì)體的細(xì)胞核，并通過(guò)酵母單雜交試驗(yàn)證明其具有轉(zhuǎn)錄激活活性，酵母實(shí)驗(yàn)還揭示了L基序?qū)aNAC29的轉(zhuǎn)錄激活活性是必需的。TaNAC29基因在小麥葉片中具有較高的表達(dá)水平，在小麥成熟衰老葉片中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在幼嫩綠色葉片中的表達(dá)水平，這一結(jié)果暗示TaNAC29基因可能參與小麥葉片的衰老進(jìn)程。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，小麥幼苗經(jīng)過(guò)高鹽、PEG6000、過(guò)氧化氫以及ABA處理后，TaNAC29基因在小麥葉片和根中的表達(dá)水平均明顯增加。為

4、了檢驗(yàn)TaNAC29基因的生物學(xué)功能，我們獲得了TaNAC29過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥。轉(zhuǎn)基因植物發(fā)芽和根長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)證明了過(guò)表達(dá)TaNAC29能顯著提高對(duì)高鹽和脫水脅迫的耐受性，轉(zhuǎn)基因擬南芥還表現(xiàn)出對(duì)外源ABA過(guò)敏性響應(yīng)。TaNAC29過(guò)表達(dá)植株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)期，均增加了對(duì)高鹽和干旱脅迫的耐受性，并且在生殖生長(zhǎng)期間，還表現(xiàn)出延遲抽薹和開(kāi)花現(xiàn)象。此外，在高鹽或脫水脅迫條件下，TaNAC29過(guò)表達(dá)植物可以積累更少的丙二醛和過(guò)氧化氫，具有更高的

5、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性。在黑暗條件下，TaNAC29轉(zhuǎn)基因小麥初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯出離體葉片衰老加速的現(xiàn)象，表明TaNAC29基因正調(diào)控植物葉片的衰老。
　　3）基因TaNAC2D定位于小麥的5BL染色體上。轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)也證明TaNAC2D是一個(gè)轉(zhuǎn)錄活化因子，其單獨(dú)的羧基端（173-327）足以激活報(bào)告基因的表達(dá)。TaNAC2D也定位于小麥原生質(zhì)體細(xì)胞核中，符合轉(zhuǎn)錄因子的特征。TaNAC2D基因在小麥葉片中的表達(dá)水平高于其它

6、器官?；虮磉_(dá)模式分析表明，小麥幼苗在高鹽、脫水、ABA以及過(guò)氧化氫處理下，TaNAC2D基因都上調(diào)表達(dá)。為了明確TaNAC2D基因的生物學(xué)功能，我們獲得了TaNAC2D基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥。在土壤中生長(zhǎng)了35天的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系分別經(jīng)過(guò)高鹽和干旱脅迫處理后，TaNAC2D過(guò)表達(dá)植株比野生型植株表現(xiàn)出更高的敏感性響應(yīng)，但在種子萌發(fā)以及萌發(fā)后生長(zhǎng)期間，相對(duì)于野生型植物，TaNAC2D過(guò)表達(dá)植物則提高了對(duì)高鹽、脫水以及氧化脅迫的耐受性。

7、為了進(jìn)一步理解這兩種不同的表型反應(yīng)，我們分析了相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)水平。在1/2 MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)了14天的擬南芥幼苗浸泡在高鹽中6 h或脫水處理1 h，相對(duì)于野生型植物，TaNAC2D過(guò)表達(dá)植物中的NCED3、RD29A和RD29B基因的轉(zhuǎn)錄水平都顯著上調(diào)，然而，在土壤中生長(zhǎng)了35天的植物浸泡在高鹽中6 h或脫水處理3 h，相對(duì)于野生型植物，這些標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)基因植物中幾乎都下調(diào)表達(dá)。
　　綜合上所述，TaNAC29過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物