2001-2007年H9N2亞型AIV生物學(xué)特性研究及其HA和NA基因的序列分析.pdf

1、禽流感是由A型流感病毒引起的禽類傳染病，臨床表現(xiàn)為呼吸道感染，產(chǎn)蛋量下降，頭頸水腫和腹瀉。H9亞型禽流感為低致病力禽流感，能引起少量死亡或不死亡，表現(xiàn)為生長障礙和產(chǎn)蛋量下降。禽流感病毒變異頻繁，傳播速度快，給疫情的防控造成巨大的困難，使世界養(yǎng)禽業(yè)遭受巨大損失。研究并掌握禽流感的生物學(xué)特性和遺傳進(jìn)化規(guī)律，對有效的防治禽流感疫情有重要意義。為了掌握我國H9亞型禽流感的變異情況和流行規(guī)律，本研究從生物學(xué)特性和分子水平上對2001年-2007年

2、從我國部分省市的養(yǎng)殖場分離到的10株禽流感H9N2亞型毒株進(jìn)行致病力、免疫相關(guān)性和分子遺傳規(guī)律等方面的研究。 首先通過血凝特性的測定、雞胚致病力的測定、雞胚平均死亡時間的測定和1日齡雛雞腦內(nèi)接種指數(shù)測定等方法對10株禽流感H9N2亞型毒株的致病力進(jìn)行分析和比較。從中選出代表不同地區(qū)，不同時間分離到的6株病毒，用有限稀釋法對這6株病毒進(jìn)行純化，制備單因子血清，進(jìn)行雙交叉HI試驗(yàn)，從而分析它們的抗原相關(guān)性。結(jié)果表明：本試驗(yàn)分離到的2

3、001年-2007年我國多個地區(qū)的這10株禽流感HgN2亞型毒株的致病力不強(qiáng)，其HA效價在29～210之間，對標(biāo)準(zhǔn)抗原的HI效價在11log2～13log2之間，EID50在10-5.62/0.2mL～10-8.69/0.2mL之間，其中ACSD307毒株的EID50為10-8.68/0.2mL，表出較其他9株病毒強(qiáng)的致病力，其他9株病毒的EID50在10-5.62/0.2mL～10-6.57/0.2mL之間。這10株病毒的雞胚平均死亡

4、時間差異不大，在90.0h～108.1h之間。其中ACSD307毒株的雞胚平均死亡時間最短為90.0h，說明該病毒的致病力較強(qiáng)；而其他病毒的雞胚平均死亡時間都在90h以上，說明它們的致病力較弱。不同時期和不同地區(qū)分離株的抗原性有所差異但沒有發(fā)生根本性變化，試驗(yàn)選用的6株病毒的抗原相關(guān)性在0.78～0.95之間，同一病毒的單因子血清對該病毒的HI效價較高；ACHN102毒株對這6種血清的HI效價差異最小為0～1個滴度；ACTJ104毒株對

5、這6種血清的HI效價差異最大為1～2.75個滴度。ACSD307毒株的致病力較其他毒株強(qiáng)而其他毒株的致病力沒有大的差別，由此推測在實(shí)際生產(chǎn)中疫苗的選擇壓力下可能出現(xiàn)更高毒力的毒株。 其次從分子水平上對這10株禽流感H9N2亞型毒株的HA基因和NA基因的核苷酸變異和遺傳進(jìn)化規(guī)律進(jìn)行研究。采用RT-PCR技術(shù)對其HA和NA基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和測序，并對所得全序列進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，HA基因片段的大小為1742bp左右

6、，開放性閱讀框的位置均為34～1716位核苷酸，均編碼560個氨基酸。NA基因片段的大小在1442～1450bp之間，開放性閱讀框的位置均為20～1420位核苷酸，均編碼466個氨基酸。這10個毒株的HA裂解位點(diǎn)均為RSSR↓GLF，9株病毒有7個潛在糖基化位點(diǎn)，只有ACHB101在145位出現(xiàn)新的潛在糖基化位點(diǎn)。198位受體結(jié)合位點(diǎn)變異較多，分別有T、V、A三種情況，ACHN102的191位受體結(jié)合位點(diǎn)變異成絲氨酸(S)，而其他毒株該

7、位置均為天冬酰胺(N)。在NA基因可能的HB位點(diǎn)上表現(xiàn)出較大的變異，在366～373位點(diǎn)區(qū)域的368位變異較大，在399～404位點(diǎn)區(qū)域的401位的氨基酸變化較大。而且這10個毒株NA氨基酸序列存在6個潛在的糖基化位點(diǎn)；氨基酸序列在第63、64、65位氨基酸有T、E、I三個氨基酸的缺失，這也導(dǎo)致61位糖基化位點(diǎn)的丟失。唾液酸吸附位點(diǎn)上有明顯的突變。從整體分析，本試驗(yàn)分離的10株病毒的HA和NA基因變異程度不大；在遺傳進(jìn)化樹中均屬于歐亞分