水稻蛋白酪氨酸磷酸酶基因OsPTP1的分子生物學研究.pdf

1、非生物脅迫是影響植物生長發(fā)育和產(chǎn)量的重要環(huán)境因素，而其中又以干旱、鹽漬和低溫的影響最為嚴重。植物是如何感受并識別逆境信號，傳遞逆境信息，激活一系列信號分子并調(diào)控相關基因的表達及生理生化反應以維持其正常的生長發(fā)育，即植物細胞信號轉(zhuǎn)導問題，現(xiàn)已成為生命科學研究的熱點。在真核生物中，蛋白質(zhì)的“可逆磷酸化”作為一項普遍而重要的調(diào)控機制，幾乎參與調(diào)控著生命活動的每個過程，細胞的生長和分化、基因復制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)的修飾和代謝調(diào)控、分子識別和信號

2、轉(zhuǎn)導等都與蛋白質(zhì)的可逆磷酸化密切相關。隨著蛋白酪氨酸磷酸酶在高等植物中的發(fā)現(xiàn)，它們的功能也受到了科學家的重視。生化和遺傳分子生物學的研究表明，蛋白酪氨酸磷酸酶通過調(diào)節(jié)可逆磷酸化過程，在植物逆境信號傳遞中發(fā)揮著重要作用，但是有關蛋白酪氨酸磷酸酶參與逆境信號傳遞途徑的作用機制尚不明了。
　　 本實驗室在前期研究中，從水稻中克隆到一個蛋白酪氨酸磷酸酶基因(命名為OsPTP1)，其編碼區(qū)長度為666bp，編碼含有222個氨基酸殘基的蛋白

3、質(zhì)。酶活分析表明，該酶屬于酪氨酸特異性磷酸酶。為了進一步明確OsPTP1基因的生物學功能及其在植物逆境脅迫下的信號轉(zhuǎn)導途徑，本研究通過酵母雙雜交及過表達等技術(shù)，結(jié)合生物信息學分析，對該基因的作用機理進行了分析研究。
　　 主要結(jié)果如下：
　　 1.通過生物信息學的方法，對水稻蛋白酪氨酸磷酸酶基因OsPTP1進行了結(jié)構(gòu)和功能分析。采用TMpred跨膜結(jié)構(gòu)分析軟件，發(fā)現(xiàn)該基因的序列均屬于親水區(qū)，不含跨膜結(jié)構(gòu)域，可能不定位于膜

4、上，為非受體型PTPases；選取來自不同物種的14個PTPases基因，對其蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域比對結(jié)果表明，其催化結(jié)構(gòu)域高度保守；聚類分析表明OsPTP1基因與來自擬南芥、楊樹、玉米、葡萄、辣椒等植物中的PTPases基因在整個系統(tǒng)進化樹上形成單獨的一枝，且與來自動物界、真菌界的PTPases基因明顯區(qū)分開；
　　 2.利用酵母中與OsPTP1同源基因SIW14的突變體，通過酵母互補的方法對OsPTP1的蛋白磷酸酶功能進行驗證

5、。結(jié)果表明，突變體對高鹽敏感，而轉(zhuǎn)入pYES2-OsPTP1載體的酵母突變體菌株生長狀況得到恢復；
　　 3.通過半定量RT-PCR技術(shù)分析了水稻中OsPTP1基因的誘導表達情況。結(jié)果顯示，在干旱、ABA、H2O2等三個因素的誘導下，OsPTP1基因均能上調(diào)表達，提示該基因可能參與植物逆境脅迫下的信號通路；
　　 4.將OsPTP1基因轉(zhuǎn)化煙草(NC82)進行過表達，并檢測其逆境脅迫下的表型及生理指標的變化情況。結(jié)果表明

6、，在干旱條件下，轉(zhuǎn)基因植株的抵抗能力要明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株；較之野生型煙草，OsPTP1過表達煙草葉片萎蔫程度明顯增加，氣孔開放度增大，氣孔孔徑的降低程度也要低于野生型，且葉片中游離脯氨酸的含量顯著提高。在高鹽處理條件下，OsPTP1過表達煙草葉片也表現(xiàn)出一定程度的水漬化、內(nèi)含物流失等現(xiàn)象，而且轉(zhuǎn)基因煙草T0代種子的萌發(fā)率受到高鹽的抑制。但低溫脅迫下，兩者在表型和生理上沒有明顯的區(qū)別，提示OsPTP1基因可能作為一個負調(diào)控因子，參與植物

7、在干旱、高鹽等逆境脅迫下的信號通路；
　　 5.通過酵母雙雜交系統(tǒng)，成功構(gòu)建了pGBKT7-OsPTP1誘餌載體以及水稻幼苗cDNA文庫，并通過酵母共轉(zhuǎn)化的方法篩選到10余個與OsPTP1相互作用的蛋白。這些蛋白質(zhì)包括轉(zhuǎn)錄因子，如MADS-BOX、WRKY等、蛋白激酶、擴張蛋白、磷脂轉(zhuǎn)運ATP酶等，并且對擴張蛋白OsEXPA7與OsPTP1的互作關系進行了驗證；
　　 6.提出了一個OsPTP1基因參與植物氣孔運動和發(fā)育