雞巨型艾美球蟲GAM56基因核酸疫苗的構建及其免疫保護效果.pdf

1、本研究以GAM56基因為研究對象，構建了雞球蟲核酸疫苗，并通過雞體試驗評價了其免疫原性和免疫保護效果，旨在為其臨床用于雞球蟲病的預防控制提供理論依據(jù)。 1、巨型艾美球蟲配子體GAM56基因核酸疫苗的構建及鑒定 以含E.maxima NT株配子體基因cDNA片段的質粒pGEM-T-gam56 DNA為模板，設計一對引物，對GAM56基因含ORF的片段進行PCR擴增，擴增得到與預期大小相符的1465 bp的片段。將擴增的GA

2、M56基因插入到真核表達載體pcDNA3.1(+)中，經EcoRI和HindIII酶切鑒定和陽性重組質粒序列測定證實，GAM56片段正確的閱讀框架插入了pCDNA3.1的多克隆位點，基因序列未發(fā)生變異。以切膠免疫的鼠源抗GAM56蛋白片段高免血清為一抗，F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠IgG為二抗，對轉染GAM56基因的COS-1細胞中GAM56基因表達情況進行了IFA檢測。轉染后72h，在部分COS-1細胞胞漿內和細胞膜上均有GAM56基因的表達

3、，顯現(xiàn)較強的熒光信號，證明所構建的核酸疫苗體外在真核細胞中能正確地表達GAM56基因。 2、雞巨型艾美球蟲配子體GAM56基因核酸疫苗免疫原性的研究 為了探討所構建的核酸疫苗是否具有免疫原性，將pcDNA3.1-GAM56質粒分別以100μg、50μg、25μg三個劑量胸肌注射免疫黃羽肉雞，7日齡首免，14日齡時以相同劑量和途徑加強免疫一次，同時設立PBS和空質粒對照組，每組20只雞。分別于7、14、21、28日齡每組隨

4、機抓取5只，無菌心臟采血2 mL，進行血液淋巴細胞轉化試驗和血清特異性抗體的ELISA檢測，分析其細胞免疫和體液免疫水平的變化。結果表明：首免后7d，DNA疫苗各劑量組即能顯著增強淋巴細胞的增殖水平(P<0.05)，且以pcDNA3.1-GAM56(50μg)中劑量組的淋巴細胞增殖水平最高，首免后14和21 d，淋巴細胞增殖水平繼續(xù)提高。利用間接ELISA法測定抗體水平發(fā)現(xiàn)首免后7d各核酸疫苗免疫組均有特異性抗體產生，其中pcDNA3.

5、1-GAM56(50μg)中劑量組的抗體水平顯著高于其他核酸劑量組(P<0.05)，首免后14和21 d，特異性抗體水平繼續(xù)提高。結果顯示，該核酸疫苗具有良好的免疫原性。 3、雞巨型艾美球蟲配子體GAM56基因核酸疫苗的免疫保護效果 將pcDNA3.1-GAM56分別以100μg、50μg25μg三個劑量胸肌注射免疫黃羽肉雞，7日齡首免，14日齡時以相同劑量和途徑加強免疫_次，同時設立PBS和空質粒對照組，每組10只雞。

6、于21日齡時，除未免疫未攻蟲組每雞經嗉囊接種5×104E.maxima NT株孢子化卵囊，7d后稱重撲殺。對各組的存活率、相對增重率、卵囊減少率等指標進行統(tǒng)計分析，比較免疫保護效果。結果顯示，就增重而言，在三個劑量組中，pcDNA3.1-GAM56(50μg)中劑量組的相對增重率最高，達89.68％，效果最好；就卵囊產量而言，pcDNA3.1-GAM56(50μg)中劑量組能有效地減少卵囊產量，卵囊減少率最高，為53.66％。以上結果表