巨型艾美球蟲配子體gam56基因的克隆與表達及其免疫保護性試驗.pdf

1、雞球蟲病(Coccidiosis)是由艾美屬(Eimeria)的多種球蟲寄生于雞消化道引起的一種嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的原蟲病，全世界每年因雞球蟲病而造成的經濟損失高達20億美元以上。我國是養(yǎng)雞大國，占世界總養(yǎng)雞量的10％，每年由雞球蟲病造成的直接和間接經濟損失難以估計。目前球蟲病主要依靠藥物防治，但由于球蟲耐藥性的不斷增強以及藥物殘留肉蛋危害人體健康，使得藥物防治雞球蟲病舉步維艱，也迫使人們將目光轉向免疫預防等替代控制方法。本研究對巨型艾

2、美球蟲南通株(E.maxima，NT株)配子體抗原gam56基因進行了克隆、序列分析和原核表達，以及gam56抗原對E.maxima的免疫保護作用，為在臨床上利用亞單位疫苗控制雞球蟲病奠定基礎。 一、巨型艾美球蟲配子體gain 56基因的克隆和序列分析以Emaxima NT株純化的配子體提取的總RNA為模板，設計特異性引物，應用兩步法RT-PCR技術擴增出gam56基因的特異性片段。將擴增片段插入pGEM-T載體，隨機選擇經藍白

3、斑篩選、PCR及酶切鑒定為陽性的2個克隆分別進行測序分析，并對結果進行驗證。結果顯示，2個陽性克隆所含插入片段的DNA序列完全一致，含一全長1431個核苷酸的開放閱讀框。其序列與EmaximaHoughton株的開放閱讀框一致。 二、巨型艾美球蟲配子體gam 56基因在大腸桿菌中的融合表達根據Emaxima NT株gam56抗原基因的cDNA序列設計2對引物，經PCR從陽性質粒模板中擴增出gam56基因不含信號肽的編碼區(qū)片段。將

4、該基因片段酶切回收后按正確的閱讀框架克隆入大腸桿菌表達載體pGEX-6P-1谷光甘肽-S-轉移酶基因的下游，構建重組表達質粒pGEX-6P-1-gam56-1和pGEX-6P-1-gam56-2，并經測序驗證。重組菌經過IPTG誘導后，通過SDS-PAGE電泳，gam56基因的2個片段在大腸桿菌中得到了融合表達，融合蛋白分子量分別約為44 Ku和38 Ku?？扇苄苑治霰砻鳎琾GEX-6P-1-gam56-1融合蛋白主要以包涵體形式存在，

5、而pGEX-6P-1-gain56-2融合蛋白則主要以可溶性形式存在。三、巨型艾美球蟲重組抗原gam56-2的免疫保護效果試驗以Eaxima配子體抗原的基因工程重組菌pGEX-6p-1.gam56-2/BL21誘導表達產物-重組gam56-2蛋白為抗原，加或不加弗氏完全佐劑，制備免疫原。分別設3個劑量組，經皮下注射，于5日齡、12日齡和19日齡對雛雞進行3次免疫，同時設立未免疫未攻毒組和未免疫攻毒組作對照。在26日齡時用5×104個Em

6、axima南通株孢子化卵囊進行攻毒，8 d后撲殺，對各組的存活率、相對增重率、病變記分減少率、卵囊減少率和抗球蟲指數(ACI)等指標進行統(tǒng)計分析，比較免疫保護效果。結果顯示，就相對增重率而言各免疫組較未免疫攻毒組的要高27個百分點以上，均有一定的保護作用；但就病變記分減少率與卵囊減少率指標而言，各免疫組均小于70％與75％，判為無保護力；而從抗球蟲指數水平來看，重組蛋白中劑量佐劑組、重組蛋白低劑量佐劑組與重組蛋白中劑量組的抗球蟲指數均在