鴨坦布蘇病毒的分子生物學(xué)快速診斷與E蛋白基因變異性分析.pdf

1、2010年6月以來，我國鴨主產(chǎn)區(qū)的蛋鴨和種鴨暴發(fā)了一種新的傳染病，主要特征為產(chǎn)蛋鴨卵泡充血、出血和變性。該病病原是一種黃病毒，基因組為單股正鏈RNA，全長10990nt，分類上和Tembusu病毒親緣關(guān)系最近，定名為鴨坦布蘇病毒(DuckTembusuvirus，DTMUV)。為了開展“鴨坦布蘇病毒感染”的流行病學(xué)調(diào)查和提高疫病診斷準(zhǔn)確性，本研究建立了DTMUV一步法RT-PCR和一步法熒光定量RT-PCR檢測方法，對不同禽種、時間和地

2、區(qū)DTMUV的E蛋白基因進(jìn)行克隆和測序，分析該病毒的變異性，這為該病的防控技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 本研究主要分為3部分：
　　 1.DTMUV一步法RT-PCR檢測方法的建立
　　 在對DTMUV序列進(jìn)行比對分析的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)一對特異性引物，通過優(yōu)化RT-PCR反應(yīng)條件，建立了DTMUV一步法RT-PCR檢測方法。該方法具有特異、快速、敏感、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可以在2個小時內(nèi)檢出1.82個TCID50的病毒核酸。對

3、2010年至2011年6月份前的106份產(chǎn)蛋下降鴨群臨床病料進(jìn)行檢測，結(jié)果陽性率為46.2％，表明DTMUV在浙江及其周邊省份的產(chǎn)蛋鴨群具有較高的感染率。
　　 2.DTMUV一步法熒光定量RT-PCR檢測方法的建立
　　 在對DTMUV序列進(jìn)行比對分析，根據(jù)MGB探針實(shí)時熒光定量PCR原理，在3’端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)一對特異性引物和一條MGB探針，通過優(yōu)化一步法熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件，建立了DTMUV一步法熒光定量RT

4、-PCR檢測方法。該方法具有特異、快速、敏感的特點(diǎn)。可以在2個小時內(nèi)檢出10copies/μL的體外轉(zhuǎn)錄RNA量。與建立的DTMUV一步法RT-PCR檢測方法進(jìn)行比對，一步法RT-PCR陽性率為46.2％，而一步法熒光定量RT-PCR陽性率為74.6％，其中鵝病料組織陽性率為69.1％(29/42)，表明建立的一步法實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測方法比一步法RT-PCR檢測方法具有更高的敏感性，在對臨床病料檢測中發(fā)現(xiàn)鵝群中DTMUV也具有

5、較高的感染率。
　　 3.鴨坦布蘇病毒E蛋白基因變異性分析
　　 通過對不同來源的35株鴨坦布蘇病毒E蛋白基因進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)不同來源的各株病毒之間核酸和氨基酸的同源性分別為97.0％～100％和97.4％～100％，其中主要的變異位點(diǎn)為第191位核苷酸(其中有17株為A，有18株為G)導(dǎo)致第64位氨基酸的不同(17株為賴氨酸，18株為精氨酸)，該氨基酸位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換與毒株的分離時間、地點(diǎn)和品種間沒有關(guān)聯(lián)