家蠶TIME-EA4進(jìn)化及晝夜節(jié)律生物鐘基因的克隆、進(jìn)貨和反饋環(huán)路研究.pdf

1、家蠶(Bombyx mori)是卵滯育性鱗翅目模式昆蟲,其滯育卵的活化與滯育發(fā)育時(shí)間間隔測(cè)定酶酯酶A4密切相關(guān)。TIME-EA4具備穩(wěn)定的Cu／Zn SOD活性和只在卵滯育末期出現(xiàn)的生物鐘測(cè)時(shí)功能瞬時(shí)酯酶ATPase活性。晝夜節(jié)律是最普遍的生物節(jié)律現(xiàn)象,受遺傳生物鐘基因調(diào)控,而家蠶的卵滯育是其對(duì)晝夜節(jié)律授時(shí)因子(溫度和光照等)響應(yīng)的一種現(xiàn)象,這為我們研究家蠶晝夜節(jié)律生物鐘基因提供了一個(gè)很好的參照。為了深入研究家蠶TIME-EA4的分子作

2、用機(jī)制,本文首先從蛋白質(zhì)分子進(jìn)化角度研究了TIME-EA4雙重酶活性的發(fā)生機(jī)制；同時(shí)為了進(jìn)一步研究TIME-EA4生物測(cè)時(shí)與晝夜節(jié)律生物鐘信號(hào)途徑的關(guān)系,本文克隆、分析和初步整合了家蠶晝夜節(jié)律生物鐘基因反饋環(huán)路。
　　 本文首先克隆了17個(gè)物種的Time-ea4同源基因Time-likes,從NCBI中獲得17-20個(gè)物種的Cu／Zn SOD、羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶蛋白序列,通過(guò)比對(duì)、MOTIFS、進(jìn)化蹤跡、位點(diǎn)掃描、聚類等方法

3、系統(tǒng)的分析了TIME-EA4的分子進(jìn)化。同時(shí),通過(guò)RT-PCR和RACE方法克隆了家蠶晝夜節(jié)律生物鐘基因Bmcry1與Bmcry2的全長(zhǎng)cDNA序列,電子克隆(in silico cloning)了Bmvri,Bmcyc,Bmtim2,Bmpdp完整的ORF序列,以及Bmclk基因的ORF片段。在此基礎(chǔ)上,對(duì)上述基因及其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析、染色體定位和系統(tǒng)的分子進(jìn)化分析,最后根據(jù)這些基因及其表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征結(jié)合現(xiàn)有的數(shù)據(jù)資源,初步

4、整合了家蠶晝夜節(jié)律生物鐘反饋環(huán)路。結(jié)果如下：
　　 ⑴家蠶TIME-EA4起源于Cu／Zn SOD。家蠶TIME-EA4及多物種中其同源蛋白(TIME-Iikes)都與Cu／Zn SOD的序列相似性較高(33％～100％),屬于Cu／Zn SOD超家族,都具有Cu／Zn SOD特征序列(SOD_CU_ZN_1和SOD_CU_ZN_2motifs)。TIME-EA4具有穩(wěn)定的Cu／ZnSOD活性和Cu／Zn離子結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)化蹤跡分

5、析顯示TME-EA4的重要氨基酸殘基(coverage<25％)的91.2％都用來(lái)維持與Cu／Zn SOD的序列一致性。在選取的非昆蟲物種中,TIME-like就是該物種的Cu／Zn SOD,而在一些昆蟲物種中TIME-like是有別于Cu／Zn SOD蛋白。根據(jù)進(jìn)化史,自從有光合生物,就有Cu／ZnSOD的結(jié)論,本文僅在昆蟲中找到TIME-EA4和TIME-likes,說(shuō)明TIME-EA4比Cu／Zn SOD出現(xiàn)得晚,因此推測(cè)家蠶TI

6、ME-EA4起源于Cu／Zn SOD。
　　 ⑵家蠶TIME-EA4是一種新型酯酶。家蠶TIME-EA4最初是通過(guò)酯酶分離純化方法獲得的一種酯酶,能夠被酯酶特異性染料著色,其N-末端有ATPase結(jié)構(gòu)域,是發(fā)揮時(shí)間間隔測(cè)定功能的位點(diǎn)。TIME-EA4與Cu／Zn SOD的Cu／Zn離子綁定位點(diǎn)在氨基酸殘基組成、極性和接觸原子等方面存在著差異。TIME-EA4除具有Cu／Zn SOD功能位點(diǎn)外,還具有酯酶的功能位點(diǎn)。家蠶TIME-

7、EA4和野桑蠶(Bombyx mandarina)的TIME-like(Bm-TIME-like)與酯酶進(jìn)化距離較近,其他4個(gè)昆蟲物種的TIME-likes與酯酶和非脊椎動(dòng)物的Cu／Zn SOD聚為一大類。推測(cè)TIME-EA4(TIME-likes)是起源于Cu／Zn SOD的新型酯酶,在不同的昆蟲物種中,TIME-EA4(TIME-likes)以不同速率向酯酶進(jìn)化,家蠶由于數(shù)千年的人工馴化加速了這一進(jìn)化過(guò)程。
　　 ⑶家蠶具有

8、兩類晝夜節(jié)律核心鐘基因Bmcry1與Bmcry2。通過(guò)電子克隆、RT-PCR和RACE技術(shù)獲得了家蠶Bmcry1與Bmcry2全長(zhǎng)cDNA序列,長(zhǎng)度分別為2166 bp和2389 bp(HM747059和HM747060),拼接了全基因序列(HM747057和HM747058)。Bmcry1基因具有12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子,Bmcry2具有9個(gè)外顯子,8個(gè)內(nèi)含子。染色體定位表明Bmcry1和Bmcry2分別位于17號(hào)和15號(hào)染色體。同

9、源建模獲得了BmCRY1和BmCRY2蛋白的三維結(jié)構(gòu),其FAD入口大而深,與CRY不結(jié)合嘧啶二聚體相符:BmCRY1和BmCRY2表面多為負(fù)電荷,只在FAD入口位置有正電荷富集。多序列比對(duì)、蛋白質(zhì)基序、功能域、聚類分析等結(jié)果顯示,BmCRY1和BmCRY2分屬昆蟲CRY1和CRY2,與柞蠶(Antheraea pernyi)等鱗翅目昆蟲CRY蛋白親緣關(guān)系最近。家蠶的2類CRY與其他昆蟲CRY相似,都具有DNA光解酶和FAD結(jié)合功能域,但

10、保守位點(diǎn)和基序位點(diǎn)不同。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究家蠶CRY1和CRY2的分子進(jìn)化機(jī)制和功能創(chuàng)造了條件。
　　 ⑷家蠶晝夜節(jié)律生物鐘基因的挖掘與反饋環(huán)路的初步整合?？寺×思倚QBmvri,Bmcyc,Bmtim2,Bmpdp完整的ORF序列及Bmclk基因的ORF片段?；蚪Y(jié)構(gòu)分析和染色體定位表明:Bmvri基因具有2個(gè)外顯子,1個(gè)內(nèi)含子,位于家蠶的第27號(hào)染色體的nscaf3072上；Bmpdp基因具有7個(gè)外顯子,6個(gè)內(nèi)含子,位于家蠶第

11、1號(hào)染色體的nscaf2734上；Bmtim2基因具有21個(gè)外顯子,20個(gè)內(nèi)含子,位于家蠶的第9號(hào)染色體的nscaf3048上；Bmcyc基因具有10外顯子,9個(gè)內(nèi)含子,位于家蠶第1號(hào)染色體的nscaf2734上。Bmpdp與Bmcyc位于同一條染色體的同一個(gè)nscaf上,只是具體位置有差異。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,家蠶VRI、PDP、PER、TIM1、TIM2和CYC分屬昆蟲相應(yīng)蛋白組群,同綱目昆蟲同源蛋白進(jìn)化距離較近,符合它們的親緣關(guān)系。

12、無(wú)論是進(jìn)化距離還是功能域,昆蟲TIM2都與脊椎動(dòng)物TIM1相近,可見(jiàn)脊椎動(dòng)物TIM1在昆蟲中的真正同源蛋白是TIM2,不是TIM1。
　　 ⑸功能域和MOTIFS分析表明,BmVRI和BmPDP蛋白的DNA結(jié)合功能域氨基酸序列很相似,推測(cè)它們可以結(jié)合相同的DNA序列,即Clk基因的啟動(dòng)子。BmPER和BmTIM(TIM1和TIM2)都不具備DNA結(jié)合位點(diǎn),但它們都具有蛋白質(zhì)互作基序位點(diǎn),可知PER和TIM可通過(guò)蛋白質(zhì)互作實(shí)現(xiàn)信號(hào)