人工晝夜節(jié)律對鼠視網(wǎng)膜發(fā)育與生物鐘基因CRY1表達的影響及中醫(yī)陰陽鐘調(diào)整干預作用的研究.pdf

1、本課題采用動物實驗的研究方法,探討在改變了自然晝夜節(jié)律的人工光環(huán)境下,大鼠視網(wǎng)膜的形態(tài)、功能改變與視網(wǎng)膜生物鐘基因Cry1的表達,同時觀察應(yīng)用夏桂成老中醫(yī)陰陽鐘調(diào)整理論對視網(wǎng)膜光損傷及視網(wǎng)膜鐘基因表達的保護與調(diào)整作用。
　　 目的：通過動物實驗的方法探討人工晝夜節(jié)律對SD大鼠視網(wǎng)膜功能、形態(tài)以及視網(wǎng)膜生物鐘基因Cry1的影響,并觀察夏桂成陰陽鐘調(diào)整理論對視網(wǎng)膜光損傷的保護與生物鐘基因的調(diào)整作用。
　　 方法：健康無眼病的

2、雄性SD大鼠48只,隨機分成4組,每組12只。對照組飼養(yǎng)在正常晝夜交替節(jié)律的環(huán)境中,接受自然光線的照射;實驗組分為模型組,和A、B兩個中藥組,飼養(yǎng)在人工晝夜節(jié)律環(huán)境下,接受人工光源的循環(huán)照射,設(shè)定每日的光照時間為:明(早6:00至晚24:00),暗(晚24:00至早6:00),循環(huán)交替時間為18h/6h。根據(jù)夏桂成陰陽鐘調(diào)整理論及其所擬補陽、補陰兩種復方中藥制劑每日灌胃兩次,出于對大鼠晝伏夜出生活習性的考慮,中藥A組大鼠予以上午10:0

3、0補陽方灌胃,夜晚22:00補陰方灌胃;中藥B組大鼠予以上午10:00補陰方灌胃,夜晚22:00補陽方灌胃。實驗第3月時,對各組大鼠行眼部常規(guī)檢查、閃光-視網(wǎng)膜電圖檢查、視網(wǎng)膜HE染色光鏡檢查、透射電鏡觀察,Cry1免疫組化,視網(wǎng)膜鐘基因Cry1提取。對實驗光源日光燈進行光學參數(shù)的測定。
　　 結(jié)果：各組SD大鼠眼部前節(jié)組織結(jié)構(gòu)檢查未見明顯差異。自然晝夜節(jié)律對照組大鼠HE染色光鏡觀察見視網(wǎng)膜各層間分界清晰,內(nèi)、外核層細胞核排列整

4、齊,有規(guī)則,外核層約排列10～12層胞核,內(nèi)核層約排列4～5層胞核,內(nèi)叢狀層呈網(wǎng)狀,比較疏松、比外叢狀層厚,神經(jīng)節(jié)細胞核淡染,在神經(jīng)纖維層內(nèi)散在分部。人工晝夜節(jié)律光環(huán)境模型組大鼠HE染色光鏡下見視網(wǎng)膜萎縮變薄,結(jié)構(gòu)不清,層數(shù)減少,外核層和內(nèi)核層界限不清,細胞核層數(shù)明顯減少,核層排列紊亂,核染色深,內(nèi)叢狀層變薄,外叢狀層消失,神經(jīng)纖維層變薄,神經(jīng)節(jié)細胞稀疏。中藥A組HE染色光鏡下見視網(wǎng)膜層數(shù)減少,內(nèi)、外核層細胞核層數(shù)減少,核染色深,與模型

5、組相類似,程度略輕。中藥B組大鼠視網(wǎng)膜普遍萎縮變薄,層數(shù)減少,外核層和內(nèi)核層無明顯分界,細胞核層數(shù)減少,核深染,排列紊亂,內(nèi)叢狀層變薄,外叢狀層消失,神經(jīng)節(jié)細胞水腫,稀疏,排列紊亂,神經(jīng)纖維層可見水腫,變薄。
　　 自然晝夜節(jié)律對照組SD大鼠透射電鏡下觀察見視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞呈橢圓形,細胞膜完整,細胞核染色質(zhì)清晰,分布均勻,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體等細胞器形態(tài)正常,光感受器外節(jié)膜盤排列整齊,內(nèi)節(jié)線粒體嵴連續(xù),呈長圓形。人工晝夜節(jié)律光環(huán)境模型

6、組透射電鏡觀察見視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞胞質(zhì)內(nèi)有空泡樣改變,內(nèi)核層及外核層胞質(zhì)均出現(xiàn)空泡樣改變,線粒體腫脹,外節(jié)膜盤結(jié)構(gòu)紊亂,板層輕度離散。中藥A組透射電鏡觀察見視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞橢圓形,形態(tài)基本正常,胞質(zhì)內(nèi)可見空泡樣改變,內(nèi)核層及外核層胞質(zhì)內(nèi)均有空泡樣改變,個別線粒體腫脹,外節(jié)盤膜結(jié)構(gòu)紊亂,板層結(jié)構(gòu)輕度離散。中藥B組見神經(jīng)節(jié)細胞層胞質(zhì)腫脹,大量空泡樣改變,可見有細胞器褪變形成的髓樣小體,內(nèi)核層細胞胞質(zhì)腫脹,呈大量空泡樣,細胞膜破裂,外核層細胞胞

7、質(zhì)腫脹,大量空泡樣改變,細胞排列紊亂,稀少,部分胞膜破壞,線粒體嵴斷裂,高度腫脹,外節(jié)膜盤組織結(jié)構(gòu)紊亂,板層結(jié)構(gòu)消失,空泡樣改變。
　　 自然晝夜節(jié)律對照組大鼠閃光-視網(wǎng)膜電圖(F-ERG)檢查波形為典型視網(wǎng)膜電圖波形,各波分化性好。各實驗組引出的波形均不典型。人工晝夜節(jié)律模型組與自然晝夜節(jié)律對照組F-ERG比較,Rod-R的b波潛時延長,Max-R的a,b波振幅下降,潛時延長,Cone-R的a,b波振幅下降,OpsOS值和30

8、HzFlickerN1-P1振幅均下降,兩組比較差異有顯著性(P＜0.05)。中藥A組與對照組大鼠F-ERG比較,Rod-R的b波潛時延長,Max-R的a,b波振幅下降,潛時延長,Cone-R的a,b波振幅下降,OpsOS值和30HzFlickerN1-P1振幅均下降,兩組比較差異有顯著性(P＜0.05)。中藥A組與模型組大鼠F-ERG比較,Max-R的a,b波振幅升高,Cone-R的b波振幅升高,兩組比較差異有顯著性(P＜0.05)。

9、中藥B組與模型組大鼠F-ERG比較,Max-R的a波潛時延長,Max-R的b波振幅下降,差異有顯著性(P＜0.05)。視網(wǎng)膜生物鐘基因Cry1免疫組化定位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層。RT-PCR基因定量檢測基因含量,模型組及中藥A組含量減少,對與照組比較有顯著性差異(P＜0.05),中藥B組含量亦減少,但與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。自然節(jié)律對照組大鼠比較安靜,實驗組中中藥A組大鼠比較安靜。其余各組表現(xiàn)為比較驚覺,躁動不安。日光燈

10、頻閃大,穩(wěn)定性差,紫外區(qū)的輻射非常明顯。
　　 結(jié)論：日光燈人工晝夜節(jié)律循環(huán)照射大鼠,對視網(wǎng)膜的組織結(jié)構(gòu)和功能有一定影響,遵循夏桂成老中醫(yī)陰陽鐘調(diào)整理論,中藥A組陽時補陽藥陰時補陰藥可能對視網(wǎng)膜內(nèi)層具有一定的保護作用,相反的中藥B組陽時補陰藥,陰時補陽藥可能對視網(wǎng)膜有加大損傷作用,以上結(jié)論尚需進一步深入研究加以證實。順應(yīng)或違逆中醫(yī)陰陽鐘調(diào)整理理論可改善或加重大鼠生物節(jié)律的紊亂,保護或加重視網(wǎng)膜損傷,為臨床上調(diào)節(jié)生物節(jié)律提供參考方