人工晝夜節(jié)律對(duì)鼠視網(wǎng)膜發(fā)育與生物鐘基因CRY1表達(dá)的影響及中醫(yī)陰陽(yáng)鐘調(diào)整干預(yù)作用的研究.pdf

1、本課題采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究方法,探討在改變了自然晝夜節(jié)律的人工光環(huán)境下,大鼠視網(wǎng)膜的形態(tài)、功能改變與視網(wǎng)膜生物鐘基因Cry1的表達(dá),同時(shí)觀察應(yīng)用夏桂成老中醫(yī)陰陽(yáng)鐘調(diào)整理論對(duì)視網(wǎng)膜光損傷及視網(wǎng)膜鐘基因表達(dá)的保護(hù)與調(diào)整作用。
　　 目的：通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法探討人工晝夜節(jié)律對(duì)SD大鼠視網(wǎng)膜功能、形態(tài)以及視網(wǎng)膜生物鐘基因Cry1的影響,并觀察夏桂成陰陽(yáng)鐘調(diào)整理論對(duì)視網(wǎng)膜光損傷的保護(hù)與生物鐘基因的調(diào)整作用。
　　 方法：健康無(wú)眼病的

2、雄性SD大鼠48只,隨機(jī)分成4組,每組12只。對(duì)照組飼養(yǎng)在正常晝夜交替節(jié)律的環(huán)境中,接受自然光線的照射;實(shí)驗(yàn)組分為模型組,和A、B兩個(gè)中藥組,飼養(yǎng)在人工晝夜節(jié)律環(huán)境下,接受人工光源的循環(huán)照射,設(shè)定每日的光照時(shí)間為:明(早6:00至晚24:00),暗(晚24:00至早6:00),循環(huán)交替時(shí)間為18h/6h。根據(jù)夏桂成陰陽(yáng)鐘調(diào)整理論及其所擬補(bǔ)陽(yáng)、補(bǔ)陰兩種復(fù)方中藥制劑每日灌胃兩次,出于對(duì)大鼠晝伏夜出生活習(xí)性的考慮,中藥A組大鼠予以上午10:0

3、0補(bǔ)陽(yáng)方灌胃,夜晚22:00補(bǔ)陰方灌胃;中藥B組大鼠予以上午10:00補(bǔ)陰方灌胃,夜晚22:00補(bǔ)陽(yáng)方灌胃。實(shí)驗(yàn)第3月時(shí),對(duì)各組大鼠行眼部常規(guī)檢查、閃光-視網(wǎng)膜電圖檢查、視網(wǎng)膜HE染色光鏡檢查、透射電鏡觀察,Cry1免疫組化,視網(wǎng)膜鐘基因Cry1提取。對(duì)實(shí)驗(yàn)光源日光燈進(jìn)行光學(xué)參數(shù)的測(cè)定。
　　 結(jié)果：各組SD大鼠眼部前節(jié)組織結(jié)構(gòu)檢查未見(jiàn)明顯差異。自然晝夜節(jié)律對(duì)照組大鼠HE染色光鏡觀察見(jiàn)視網(wǎng)膜各層間分界清晰,內(nèi)、外核層細(xì)胞核排列整

4、齊,有規(guī)則,外核層約排列10～12層胞核,內(nèi)核層約排列4～5層胞核,內(nèi)叢狀層呈網(wǎng)狀,比較疏松、比外叢狀層厚,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核淡染,在神經(jīng)纖維層內(nèi)散在分部。人工晝夜節(jié)律光環(huán)境模型組大鼠HE染色光鏡下見(jiàn)視網(wǎng)膜萎縮變薄,結(jié)構(gòu)不清,層數(shù)減少,外核層和內(nèi)核層界限不清,細(xì)胞核層數(shù)明顯減少,核層排列紊亂,核染色深,內(nèi)叢狀層變薄,外叢狀層消失,神經(jīng)纖維層變薄,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞稀疏。中藥A組HE染色光鏡下見(jiàn)視網(wǎng)膜層數(shù)減少,內(nèi)、外核層細(xì)胞核層數(shù)減少,核染色深,與模型

5、組相類似,程度略輕。中藥B組大鼠視網(wǎng)膜普遍萎縮變薄,層數(shù)減少,外核層和內(nèi)核層無(wú)明顯分界,細(xì)胞核層數(shù)減少,核深染,排列紊亂,內(nèi)叢狀層變薄,外叢狀層消失,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞水腫,稀疏,排列紊亂,神經(jīng)纖維層可見(jiàn)水腫,變薄。
　　 自然晝夜節(jié)律對(duì)照組SD大鼠透射電鏡下觀察見(jiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈橢圓形,細(xì)胞膜完整,細(xì)胞核染色質(zhì)清晰,分布均勻,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體等細(xì)胞器形態(tài)正常,光感受器外節(jié)膜盤排列整齊,內(nèi)節(jié)線粒體嵴連續(xù),呈長(zhǎng)圓形。人工晝夜節(jié)律光環(huán)境模型

6、組透射電鏡觀察見(jiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有空泡樣改變,內(nèi)核層及外核層胞質(zhì)均出現(xiàn)空泡樣改變,線粒體腫脹,外節(jié)膜盤結(jié)構(gòu)紊亂,板層輕度離散。中藥A組透射電鏡觀察見(jiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞橢圓形,形態(tài)基本正常,胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)空泡樣改變,內(nèi)核層及外核層胞質(zhì)內(nèi)均有空泡樣改變,個(gè)別線粒體腫脹,外節(jié)盤膜結(jié)構(gòu)紊亂,板層結(jié)構(gòu)輕度離散。中藥B組見(jiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層胞質(zhì)腫脹,大量空泡樣改變,可見(jiàn)有細(xì)胞器褪變形成的髓樣小體,內(nèi)核層細(xì)胞胞質(zhì)腫脹,呈大量空泡樣,細(xì)胞膜破裂,外核層細(xì)胞胞

7、質(zhì)腫脹,大量空泡樣改變,細(xì)胞排列紊亂,稀少,部分胞膜破壞,線粒體嵴斷裂,高度腫脹,外節(jié)膜盤組織結(jié)構(gòu)紊亂,板層結(jié)構(gòu)消失,空泡樣改變。
　　 自然晝夜節(jié)律對(duì)照組大鼠閃光-視網(wǎng)膜電圖(F-ERG)檢查波形為典型視網(wǎng)膜電圖波形,各波分化性好。各實(shí)驗(yàn)組引出的波形均不典型。人工晝夜節(jié)律模型組與自然晝夜節(jié)律對(duì)照組F-ERG比較,Rod-R的b波潛時(shí)延長(zhǎng),Max-R的a,b波振幅下降,潛時(shí)延長(zhǎng),Cone-R的a,b波振幅下降,OpsOS值和30

8、HzFlickerN1-P1振幅均下降,兩組比較差異有顯著性(P＜0.05)。中藥A組與對(duì)照組大鼠F-ERG比較,Rod-R的b波潛時(shí)延長(zhǎng),Max-R的a,b波振幅下降,潛時(shí)延長(zhǎng),Cone-R的a,b波振幅下降,OpsOS值和30HzFlickerN1-P1振幅均下降,兩組比較差異有顯著性(P＜0.05)。中藥A組與模型組大鼠F-ERG比較,Max-R的a,b波振幅升高,Cone-R的b波振幅升高,兩組比較差異有顯著性(P＜0.05)。

9、中藥B組與模型組大鼠F-ERG比較,Max-R的a波潛時(shí)延長(zhǎng),Max-R的b波振幅下降,差異有顯著性(P＜0.05)。視網(wǎng)膜生物鐘基因Cry1免疫組化定位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。RT-PCR基因定量檢測(cè)基因含量,模型組及中藥A組含量減少,對(duì)與照組比較有顯著性差異(P＜0.05),中藥B組含量亦減少,但與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。自然節(jié)律對(duì)照組大鼠比較安靜,實(shí)驗(yàn)組中中藥A組大鼠比較安靜。其余各組表現(xiàn)為比較驚覺(jué),躁動(dòng)不安。日光燈

10、頻閃大,穩(wěn)定性差,紫外區(qū)的輻射非常明顯。
　　 結(jié)論：日光燈人工晝夜節(jié)律循環(huán)照射大鼠,對(duì)視網(wǎng)膜的組織結(jié)構(gòu)和功能有一定影響,遵循夏桂成老中醫(yī)陰陽(yáng)鐘調(diào)整理論,中藥A組陽(yáng)時(shí)補(bǔ)陽(yáng)藥陰時(shí)補(bǔ)陰藥可能對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)層具有一定的保護(hù)作用,相反的中藥B組陽(yáng)時(shí)補(bǔ)陰藥,陰時(shí)補(bǔ)陽(yáng)藥可能對(duì)視網(wǎng)膜有加大損傷作用,以上結(jié)論尚需進(jìn)一步深入研究加以證實(shí)。順應(yīng)或違逆中醫(yī)陰陽(yáng)鐘調(diào)整理理論可改善或加重大鼠生物節(jié)律的紊亂,保護(hù)或加重視網(wǎng)膜損傷,為臨床上調(diào)節(jié)生物節(jié)律提供參考方