構(gòu)建可表達(dá)毒素基因LqhIT2并缺失egt基因的雙價(jià)重組SeMNPV.pdf

1、甜菜夜蛾核多角體病毒(Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedro virus，SeMNPV)是重要的農(nóng)業(yè)害蟲甜菜夜蛾的高效特異的病原物。SeMNPV基因組中一個(gè)非必需基因——脫皮甾體尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(ecdy steroid UDP glucosyltransferase，egt)能使被病毒感染昆蟲保持幼蟲狀態(tài)而有利于病毒的增殖。以色列黃蝎的神經(jīng)毒素基因LqhIT2的產(chǎn)物能引起昆蟲慢

2、性、持續(xù)性松弛的麻痹。在本研究中，筆者報(bào)道了通過同源重組方法和空斑純化技術(shù)，構(gòu)建了一株表達(dá)LqhIT2并缺失了egt的重組SeMNPV。 PCR法擴(kuò)增得到LqhIT2，并在其起始密碼子ATG前插入了SeMNPV的一個(gè)極早期基因iel啟動(dòng)子Piel。為了便于篩選重組病毒，將一個(gè)報(bào)告基因——綠色熒光蛋白基因(green fluorensence protein，gfp)和LqhIT2連接。在重組片段兩側(cè)連接egt基因的上下游側(cè)翼序列

3、，得到了以克隆載體pUC18為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)移載體pGFP+LqhIT2+。pGFP+LqhIT2+和SeMNPVDNA通過脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染甜菜夜蛾培養(yǎng)細(xì)胞，72小時(shí)后，在熒光顯微鏡下可以觀察到部分被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有綠色熒光。利用空斑純化法分離得到了一株重組病毒，命名為SeV1。REN和PCR分析證明gfp基因和LqhIT2已經(jīng)成功地整合在SeV1的egt基因位點(diǎn)。將SeV1注射入5齡甜菜夜蛾的血腔，30小時(shí)后，幼蟲產(chǎn)生典型的麻痹癥狀；48小時(shí)后，