生物色譜技術

1、生物色譜技術,,因為有同學沒有學習過色譜，我們大概介紹一下色譜技術的起源。色譜技術最初就是俄國的植物學家茨維特發(fā)明的。1906年，茨維特在研究植物色素的過程中，做了一個經典的實驗：在一根玻璃管的狹小一端塞上一小團棉花，在管中填充沉淀碳酸鈣，這就形成了一個吸附柱。然后將其與吸濾瓶連接，使綠色植物葉子的石油醚抽取液自柱中通過。結果植物葉子中的幾種色素便在玻璃柱上展開：留在最上面的是兩種葉綠素；綠色層下面接著葉黃素；隨著溶劑跑到吸附層最下層的

2、是黃色的胡蘿卜素。這樣吸附柱成了一個有規(guī)則的與光譜相似的色層。然后把該潮濕的吸附柱從玻璃管中推出，依色層的位置用小刀切開，于是各種色素就得以分離。再用醇為溶劑將色素溶解出來，即得到了各成分的純溶液，由此實現了色素的分離和制備。1903年，他將這一研究成果發(fā)表在華沙的《生物學雜志》上，這就是有關色譜法的第一篇研究論文。但當時他用俄文寫的報告未能引起人們的興趣，一直到他死后威爾施塔特重新介紹了這種方法時，他的工作才受到了人們的注意。,色譜法

3、,3,1903 – Mikhail Tswett defines the Science of Chromatography,Chromatography Inventor M. S. Tswett(茨維特),生物色譜法,生物色譜法（Biochromatography）是20世紀80年代中后期問世，由生命科學與色譜分離技術交叉形成的一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男屡d色譜技術。,細胞膜色譜法,親和色譜法,常規(guī)色譜法,固定相含有生物大分子,固定相和研

4、究對象都是生物大分子,研究對象是生物大分子,4,細胞膜色譜,Cell Membrane Chromatography, CMC,將細胞膜結合到硅膠表面，制成細胞膜固定相，利用色譜學技術研究流動相中藥物與受體相互作用規(guī)律的受體動力學新方法。,特點：分離 + 活性篩選 合二為一 適合于天然藥物活性成分的篩選及藥物作用機理的研究。,5,舉例,α1A腎上腺素受體高表達細胞膜色譜,a：酚妥拉明,b：5-羥色胺,c：甲氧明,d：

5、羥甲唑啉,6,親和色譜,Affinity Chromatography，AC 利用生物大分子具有對某一類生物大分子特異性識別和可逆結合的特性而建立起來的一種分離方法，也叫做生物親和或生物特異性親和色譜。,親和識別 ： 抗體-抗原 酶-底物 激素-受體,7,IgG蛋白,8,親和色譜分離原理,,2. 配體與目標物吸附；,3. 洗脫目標物；,1. 找與底物專一可逆結合的配體, 將配

6、體通過共價鍵偶聯(lián)到載體。,9,4. 親和柱再平衡。,親和體系,10,核酸結合蛋白,11,,A蛋白,12,從A型金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分離而得的一種細胞壁蛋白。可與人類大多數類型的IgG(IgG3除外)的Fc段結合，但很少或幾乎不與人類的IgM結合。用于免疫分析和IgG的提純。,葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A,SPA),免疫球蛋白 A（immunoglobu

7、lin A， IgA）,已有研究證明，呼吸道分泌液中SigA 含量的高低直接影響呼吸道粘膜對病原體的抵抗力，兩者呈正相關。1. 與病毒或細菌毒素結合，從而阻止它們進入或破壞細胞；2. 附著在細菌的鞭毛上，讓其活動性減弱，并且更容易被巨噬細 胞吞噬.,,親和色譜純化抗體原理,,13,親和色譜分離示意圖,14,親和色譜的固定相,無機氧化物：SiO2、Al2O3、ZrO3生物聚合物：纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖、葡聚

8、糖等。,固定相,1. 載體 （support，又稱基體matrix）,15,特異性配體,生物素－親和素、抗原－抗體、酶－抑制劑、激素－受體,通用性配體,凝集素－各種糖蛋白，核酸－RNA、RNA－蛋白質,2. 配位體 （ligand，又稱底物 substrate）,親和色譜的固定相,16,親和色譜的固定相,① 脂肪族有機物或多肽、蛋白組成；② 具有雙官能團，一端連接載體，一端偶聯(lián)配體；③ 長度直接影響固定相的立體效應；④ 可在對載體

9、進行化學改性的時候形成；⑤ 可具有疏水性或親水性。,3. 間隔臂 （spacer或spacer arms）,小分子物質作為配基，載體和配基間插入一個“手臂”以消除空間障礙。,17,親和色譜的洗脫方式,18,階梯式梯度,線性梯度,影響洗脫過程的因素,1. 離子強度：提高離子強度，親和作用減弱或完全破壞。2. pH值：在適當的pH下，親和結合作用較高，在其它pH下，　　　　　親和作用減弱或完全破壞。3. 離液劑：脲和鹽酸胍的存在可減

10、弱親和作用。4. 溫度：提高溫度，靜電作用、氫鍵、配位鍵減弱；　　　　疏水性相互作用增強。5. 液體離子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用減弱。6. 螯合劑：影響配位鍵，使親和作用消失,19,中壓液相色譜儀,北京東西分析儀器有限公司LC-5600系列常（中）壓生化制備液相色譜儀,20,GE公司,舉例,21,常規(guī)色譜,親和柱,22,反相色譜法,水 + 乙腈,23,反相色譜分離多肽,24,反相色譜分離多肽重現性,,

11、重現性好！,25,反相色譜分離蛋白,,26,體積排阻色譜,分子量大的先被洗脫出來，分子量小的后被洗脫出來。,原理：是按分子大小順序進行分離的一種色譜方法， 體積大的分子不能滲透到凝膠孔穴中去而被排阻，較早的淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內，最后洗出色譜柱。,27,28,體積排阻色譜,離子交換色譜,原理：利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換能力的差 異來實現分離。,29,陽離子交換樹脂

12、 大都含有磺酸基(-SO3H)、羧基(-COOH)或苯酚基(-C6H4OH)等酸性基團，其中的氫離子能與溶液中的金屬離子或其他陽離子進行交換。,2R-SO3H+Ca2+----(R-SO3)2Ca+2H+,硬水軟化原理,離子交換色譜,30,陰離子交換樹脂 大都含有季胺基[-N(CH3)3OH]、胺基(-NH2)或亞胺基(-NH2)等堿性基團。它們在水中能生成OH-離子，可與各種陰離子起交換作用。,R-N(CH3) 3O