免疫比濁法檢測(cè)免疫球蛋白

1、免疫比濁法檢測(cè)免疫球蛋白,免疫學(xué)系,實(shí)驗(yàn)原理,免疫濁度法是可溶性抗原、抗體在液相中特異結(jié)合，產(chǎn)生一定大小的復(fù)合物，形成光的折射或吸收，測(cè)定這種折射或吸收后的透射光或散射光作為計(jì)算單位。,免疫比濁法分類(lèi),,當(dāng)一束光線(xiàn)通過(guò)溶液受到光散射和光吸收兩個(gè)因素的影響而使光的強(qiáng)度減弱,,透射比濁法:在光源的光路方向（00）測(cè)量透射光強(qiáng)度和被檢測(cè)溶液微粒濃度關(guān)系的方法。,散射比濁法:在光源的光路方向（50-960）角的方向上測(cè)

2、量透射光強(qiáng)度和被檢測(cè)溶液中微粒濃度關(guān)系的方法。,透射比濁法和散射比濁法光路,檢測(cè)器A,檢測(cè)器B,IC,,,,,I0,Iθ,I,,θ,透射比濁法,散射比濁法,,,（一）基本原理 是個(gè)極其簡(jiǎn)單的方法。在抗原過(guò)量情況下，與待測(cè)樣品中相應(yīng)的Ig發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，形成可溶性復(fù)合物，使反應(yīng)介質(zhì)的濁度發(fā)生改變。 測(cè)量方法利用分光光度計(jì)測(cè)量被吸收的量。讀數(shù)以吸收單位（A）或OD值表示，A值反映了入射光和透射光的比率。待測(cè)物中Ig含量可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)

3、曲線(xiàn)計(jì)算得出。 待測(cè)樣品中的抗原含量與吸光度呈正比，而與透射光呈反比。 反應(yīng)在PEG的作用下，加速?gòu)?fù)合物的形成。,,,,免疫透射比濁法,透射比濁法測(cè)定原理,誘導(dǎo)劑,,透射比濁法測(cè)定原理,,透射比濁法的缺陷：,(1)溶液中存在的抗原－抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大，分子太小則阻擋不了光線(xiàn)的通過(guò)。(2)溶液中的抗原－抗體復(fù)合物的數(shù)量要足夠多。如果數(shù)量太小，溶液濁度變化太小，對(duì)光通量影響不大。(3) 透射比濁是依據(jù)透射光減弱的原理來(lái)定量的，因

4、此只能測(cè)定抗原－抗體反應(yīng)的第二階段，檢測(cè)仍需抗原－抗體溫育反應(yīng)時(shí)間，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。,光通量是每單位時(shí)間到達(dá)、離開(kāi)或通過(guò)曲面的光能數(shù)量,原理,散射比濁法,在入射光的一定角度檢測(cè)粒子發(fā)出的散射光，散射光的強(qiáng)度與IC的含量呈正比。,散射比濁法測(cè)定原理,誘導(dǎo)劑,散射光測(cè)定,,速率散射比濁法 （一）基本原理,,— 是測(cè)定抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。 — 所謂速率，是在單位時(shí)間內(nèi)抗原抗體結(jié)合形成 復(fù)合物的速度。將各單位時(shí)間內(nèi)形成復(fù)合

5、物的 速率及測(cè)定的散射信號(hào)連接在一起，即是動(dòng)態(tài) 的速率比濁分析。 — 當(dāng)儀器測(cè)定到某一時(shí) 間內(nèi)形成速率下降時(shí)， 即出現(xiàn)速率峰，該峰 值的高低，即代表所 測(cè)抗原的量。,,,,,,,,,,,方法評(píng)價(jià)： 敏感度高 快速(不必達(dá)平衡） 抗原抗體結(jié)合的動(dòng)態(tài)測(cè)定，理論上測(cè)定不受本底散射信號(hào)的影響 可檢測(cè)微量樣品,原理,2.終點(diǎn)散射比濁法,讓抗原抗體作用一定時(shí)間

6、，使其反應(yīng)達(dá)到平衡后，測(cè)定其IC形成的量。IC的濁度不再受時(shí)間的影響，但反應(yīng)IC聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前，進(jìn)行濁度測(cè)定。,散射比濁法的缺陷,(1)因?yàn)槭且淮涡詼y(cè)定光吸收值，沒(méi)有考慮每一個(gè)待測(cè)樣本的吸收和散射效果，可測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確(2)測(cè)定的仍是抗原－抗體反應(yīng)的第二階段，不適合快速檢測(cè)。(3) 終點(diǎn)法存在反應(yīng)本底，測(cè)定樣本的含量越低本底比例越大，故在微量測(cè)定時(shí)，本底的干擾是影響準(zhǔn)確測(cè)定的重要因素。,影響免疫比濁測(cè)定的因素,1、抗原抗體比例

7、2、抗體的質(zhì)量 抗體的特異性、效價(jià)、親和力3、反應(yīng)的溶液4、增濁劑的使用,1、透射比濁操作簡(jiǎn)便，適用于普通的自動(dòng)生化分析儀和普通的分光光度計(jì)，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)室均能開(kāi)展。不足的是靈敏度和精密度均不夠理想，所需的抗血清量大，檢測(cè)的周期較長(zhǎng)。2、散射比濁的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度、精密度均較高，檢測(cè)快速。其缺點(diǎn)是需特定的分析儀器，試劑價(jià)格高。,透射比濁法和散射比濁法優(yōu)缺點(diǎn)比較,免疫濁度法測(cè)定中應(yīng)注意的問(wèn)題1、偽濁度的影響

8、60;          偽濁度形成原因很復(fù)雜，主要是抗血清含有非特異性的交叉反應(yīng)性雜抗體成分；增濁劑濃度和反應(yīng)時(shí)間掌握不當(dāng)；樣品本身的濁度處理不當(dāng)；試劑的污染和變質(zhì)；器材尤其是比色杯等不夠清潔等因素。2、非特異性散射光的影響      免疫濁度法經(jīng)常受內(nèi)源性光散射的干擾，為避免這些非特異性光散

9、射的影響，應(yīng)用透射比濁法時(shí)需保證抗體組分在3％以下，散射比濁法需保證在 0.5％以下。,本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用聚乙二醇的生理特性 聚乙二醇是中性、無(wú)毒且具有獨(dú)特理化性質(zhì)和良好的生物相溶性的高分子聚合物，聚乙二醇即PEG具有高度的親水性，在水溶液中有較大的水動(dòng)力學(xué)體積，并且沒(méi)有免疫原性。當(dāng)藕聯(lián)到藥物分子或藥物表面時(shí)，可以將其優(yōu)良性質(zhì)賦予修飾后的藥物分子，改變它們?cè)谒芤褐械纳锓峙湫袨楹腿芙庑?，在其修飾的藥物周?chē)a(chǎn)生空間屏障，減少藥物的酶解，避