血樣dna的提取

1、實驗目的,學習高質量血樣DNA的提取，理解DNA提取操作原理，在提取過程中學習離心機、Vortex等的使用,實驗原理,應用物理、化學等方法從病人血樣中提取較純的全基因組DNA,靜置后的血液,,血液主要成分,,紅細胞,白細胞,血小板,,,,,,,,,血漿蛋白,水,其他物質,,,,無機鹽、葡萄糖、氨基酸,,血細胞種類,最多,最少,1．成熟紅細胞無核，兩面凹的圓餅狀。,功能,2．含血紅蛋白，紅色。,1．體積比紅細 胞大。,2．有核

2、，種類 繁多。,1．體積最小， 無核。,血細胞特征比較,,適中,,,促進止血，加速凝血,防御保護,運輸氧氣和部分二氧化碳,血漿主要成分,,結論,血樣各種成分中，只有白細胞含有DNA。,物理方法,離心機（型號：S×4250） : 沉淀,Vortex-5：混勻,化學試劑,溶血液: 9ml 作用：溶解紅細胞、白細胞、血小板白細胞核懸浮液：2ml 作用：使白細胞核充分懸?。☉腋≈饕?/p>

3、物理方 法：vortex）白細胞核裂解液：2ml 作用：裂解白細胞核，使DNA釋放,,化學試劑,蛋白沉淀液：1.33ml 作用：使Pr變性沉淀異丙醇：4ml 作用：洗滌并沉淀DNA70%乙醇：3ml 作用：洗去較難揮發(fā)的異丙醇、鹽離 子等,,實驗操作,血樣→ 加溶血液 → 離心 → 加核懸浮液→ 加核裂解液（立即震蕩可過夜）→ 加蛋白沉淀液（立即震蕩20s) → 離心→

4、 留上清，加入異丙醇→ 離心→ 留沉淀，加70%乙醇→ 加TE→ 測OD,實驗操作,步驟一：,血樣,,溶血液,細胞碎片、白細胞核,溶血液：( NH4Cl：155mM , NaHCO3 ：10mM , EDTANa2：1.0mM ),注意事項,能否提到高質量的DNA，好的血樣是首要前提，故采集的血樣應置于冰箱保存，并盡早進行DNA提??；做好標記：15ml離心管、1.5ml EP管均需首先進行標

5、號；移液管使用前必須消毒，減少污染；移液管頂部要塞上棉花，防止反應液吸入 移液槍內；,,注意事項,從冰箱中取出血樣時，要小心、不宜晃動，否則容易導致棄去血漿時，損失白細胞；補加溶血液時，應加至離心管12ml，即加入的溶血液體積應是原血樣的3倍左右； 溶血5min后，在燈下看管內有無血塊→If 有，可進行二次溶血；,實驗操作,離心機：4000 rpm 5min 4℃ ，使白細胞核

6、 沉淀，棄去細胞碎片等大部分雜質,,步驟二：,細胞碎片、白細胞核,,離心,沉淀：白細胞核、少量雜質（血紅素、RNA、蛋白）,注意事項,離心前注意配平，一則保護離心機，二則使離心效果更佳→ If 沉淀不緊密，可置于冰上5min,再離心一次。離心后，沉淀是白細胞核團， 離心管倒扣于吸水紙的時間不宜太長，也不宜反復倒殘余液，否則易導致白細胞核團損失。,血紅素,,注：血紅素可通過其卟啉環(huán)與Taq酶的不可逆

7、 結合而抑制 Taq酶活性，對DNA的后續(xù) 應用造成影響，必須盡量除盡,血紅素的除去,血紅素溶于水，所以可以在洗滌過程中被除去，當離心后的細胞核基本不帶紅色，說明血紅素基本已除盡,RNA,由于RNA基本上存在于細胞質中，因而細胞膜破裂后，存在于上層液體中，離心后大多數已經除去。,,實驗操作,步驟三：,,沉淀：（白細胞核、少量雜質）,,細胞核懸浮于溶液中,白細胞核懸浮液,懸浮液：( Tris-HCl：50mM、PH=8

8、.0 , NaCl：150mM （=生理鹽水：0.9%?）, EDTANa2：20mM ) 白細胞核的懸浮主要是vortex的功勞，因而要立即并充分 vortex,實驗操作,步驟四：,,細胞核懸浮液,,細胞核裂解液,DNA、大量蛋白、RNA、鹽類微量血紅素,核裂解液： ( Tris-HCl , NaCl , EDTANa2（以上各溶度

9、 同步驟三） ,SDS：2%),實驗操作,步驟五：,DNA、大量蛋白、其他雜質,,蛋白沉淀液,溶解狀態(tài)的DNA、絮狀蛋白沉淀、RNA沉淀,,離心，取上清,DNA、鹽類、微量RNA 、蛋白,蛋白沉淀液：（CH3COONH4 ：7.5M） 離心：4500rpm 15min 4℃,注意事項,細胞核的裂解是關鍵，因此必須保證充分的裂解時間，可過夜，至少一小時。加入白細胞核裂解液和蛋白沉淀

10、液時，均應立即Vortex,使反應充分。Vortex：5檔位置，20s ， 使白細胞核裂解液或蛋白沉淀液與樣品充分混勻并反應。,實驗操作,步驟六：洗滌DNA,,上清液,,絮狀DNA、微量RNA、異丙醇、鹽,異丙醇，離心，取沉淀,,絮狀DNA、乙醇,70%乙醇，離心，取沉淀,注意事項,離心機：4500 rad/min 10min 4℃ ，使洗滌后的DNA沉淀，從而洗去大部分鹽離子 加入的異丙醇的量一般為DNA溶液體積的0.

11、6-1倍加異丙醇和乙醇時，混勻方式應柔和，否則易導致DNA斷裂，故不宜使用 vortex。倒完乙醇后，為使離心管內的殘余液盡量倒干，可將其倒扣在吸水紙上，從而減少乙醇揮發(fā)時間。,實驗操作,步驟七：1×TE貯存 → OD值檢測（測濃度）、電泳檢測（測完整性） 1: 1*TE :（Tris-HCl：10mM、PH=8.0 ,

12、 EDTANa2：5mM ） 2: OD值檢測: A260/280: > 1.8 RNA污染； = 1.8 DNA提純效果好； （一般在1.8-2.0，即滿足

13、條件） < 1.8 Pr污染。 A260/230: ≥2.0 DNA提純效果較好； < 2.0 存在鹽離子、多肽、碳水化合物等污染。

14、 電泳檢測：0.8%的瓊脂糖、20ng DNA ( 對照：廢血DNA）,,,,,,實驗注意事項,若同時檢測多個所提DNA的OD值時， 由于操作時間長，微量樣品易揮發(fā)，故 宜在冰上操作。,OD值結果,,,,,,,,,,編號,3621,3619,3620,DNA含量（ng/ul),260/230,260/280,3622,1.90,1.90,1.89,2.08,2.1

15、8,2.02,2.13,2.19,1.90,3623,1.89,146.57,246.06,121.08,212.64,316.29,從以上數據可知：A260/280在1.8-2.0之間，A260/230均>2.0。說明所提DNA較純，符合要求。,電泳檢測結果,檢測結果顯示：五個樣品的條帶基本處于同一位置，且都位于10kb 的上方 ＝> 所提取的DNA 完整性較好。,討論,1、DNA儲存條件：短期（2-3天）→ 4

16、℃； 長期（兩周以上） → -80 ℃2、血樣-80度長久保存（如：1年以上）， 細胞較難裂解，應如何處理？ 答：提前一晚放到4度即可；為了速融，可置于37度水浴一 會 。3、跑電泳后主帶不再突出，向小片段方向發(fā)生彌 散，亮度比較均衡地衰減，說明DNA 出現降

17、 解，原因？解決方案？ 答：1，勻漿操作不對； 2，樣品不新鮮和冷凍保存不好,實驗總結,通過上網查詢實驗原理以及董潔老師、楊帆、楊曦師兄、藝馨、李揚師姐等的指導，對如何從血樣中提取高質量的全基因組DNA有了一個較清楚的認識。,,下一步實驗計劃,為了進一步加深對原理的理解，以及提高提DNA的實驗操作技能，計劃在董潔老師的指導下，獨立完成整個實驗操作,并且針對前幾次操作過程中不規(guī)