(生物化學(xué))dna的分離提取及含量測定n

1、DNA的分離提取及含量測定,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握從動(dòng)物組織中提取DNA的方法學(xué)習(xí)二苯胺法測定DNA含量的原理和方法,二、實(shí)驗(yàn)原理,取材原則：DNA含量高（新鮮），DNA酶活性低實(shí)驗(yàn)條件：避免機(jī)械振蕩；防止過酸、過堿對磷酸二酯鍵的破壞；抑制核酸酶：檸檬酸鈉、EDTA；SDS分離與純化的方法一般包括細(xì)胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質(zhì)分離、核酸純化等幾個(gè)主要步驟。,4. 大量組織樣本DNA提取,組織勻漿：裂解細(xì)胞離心獲得核酸-蛋

2、白復(fù)合物SDS：破壞細(xì)胞膜、核膜；分離組織蛋白與DNA改變鹽濃度分離DNA與RNA： 0.15mol/L NaCl 沉淀DNP, 1mol / L NaCl溶解DNP。氯仿-異戊醇振蕩抽提去除蛋白質(zhì)離心分離水相（DNA）與有機(jī)相乙醇沉淀DNA,真核細(xì)胞DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白（DNP），RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成RNP，可利用DNP和RNP在不同濃度NaCl中溶解度的不同來分離DNP和RNP。,DNP相 對 溶 解 度,N

3、aCl（mol/L）,鹽濃度對核蛋白溶解度的影響,氯仿去除蛋白質(zhì),氯仿——非極性分子，水——極性分子；蛋白水溶液與氯仿混合——蛋白失水變性。離心——變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大沉淀在水相下面，與溶解在水相中DNA分離。異戊酵（氯仿：異戊醇=24：1）：劇烈振蕩——降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生（混合液內(nèi)產(chǎn)生氣泡；氣泡阻止相互間充分作用） 。,乙醇沉淀DNA（脫水）,5. 小量組織/細(xì)胞樣品中DNA的制備——試劑盒

4、,6. DNA含量的測定——二苯胺法,722分光光度計(jì)檢測二茉胺法靈敏度不高，樣品中DNA含量>50μg/ml,核酸含量的測定方法,核酸是由磷酸、戊糖、堿基所組成的核苷酸的多聚高分子。三者以等分子數(shù)而存在，所以只要測定三者中任何一處成分的含量，就可推算出核酸的含量。常用的核酸測定方法有 ： 紫外吸收法 、定磷法、定糖法 RNA的定量測定：地衣酚法——核糖 DNA的定量測定：二苯胺法——脫氧糖 鉬藍(lán)法——定磷,紫外吸收法中

5、DNA或RNA的定量,A260=1.0相當(dāng)于:50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸,可見光譜:380～780nm,分光光度計(jì),比色杯,石英比色杯：3ml， 50-100μL,Biophotometer,,一次性比色杯；50μL樣品,Nanophotometer （徳）,Single and multi wavelength measurement combined with kinet

6、ic methods. The full wavelength scan (190 nm - 1100 nm) allows curve interpretation for attainment of more detailed scientific knowledge over whole spectrum. sample size as low as 0.5uL（2ng/ul ——18750 ng/ul dsDNA）。 .,The

7、rmo Scientific NanoDrop 2000c(March 2, 2009),Thermo Scientific NanoDrop 2000 and 2000c Spectrophotometers. These easy-to-use, UV-Vis instruments enable a 5-second measurement time of DNA, RNA and proteins on a sample si

8、ze as low as 0.5uL.,三、實(shí)驗(yàn)操作,兔肝200g/班，去脂，剪碎 ↓400ml冷1xSSC，5’，2-3次 ↓400ml冷1xSSC（0.15MNaCl-檸檬酸鈉）勻漿1-2’ ↓15-20ml勻漿液/組（記錄實(shí)際體積） ↓離心：6000rpm，4℃，15’ ↓記錄上清體積,,1.兔肝組織DNA的提取,沉淀 + 5V 0.15mol/L NaCl-0.1mo

9、l/LNa2EDTA ↓攪拌，滴加5%SDS→1% ↓攪拌，加固體NaCl →1mol/L ↓攪拌30’ → NaCl 全溶 ↓等V氯仿/異戊醇(24：1)，振蕩20’ ↓離心：6000rpm，4℃，15’,水相（含DNA鈉鹽）→,蛋白凝膠層→,有機(jī)相→,↓轉(zhuǎn)移水相→150ml燒杯 ↓攪動(dòng)，加2V冷95%乙醇沉淀DNA ↓70%乙醇，2’（10ml）→除鹽

10、 ↓95%乙醇，2’ （10ml）→脫水 ↓100%乙醇，2’ （10ml）→脫水 ↓吹干3ml蒸餾水溶解DNA,2. 繪制 DNA的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,樣品稀釋：,,,,,,,向1-6號管中加入4ml二苯胺試劑，混合均勻。 將上述各管放入沸水浴中精確反應(yīng)10’，冷卻。 595nm波長下測每管的吸收值。 將各管在595nm下的吸收值對加人的DNA的μg數(shù)作圖，應(yīng)得一條通過零點(diǎn)的直線。,3.兔肝DNA樣品中DNA含量的

11、測定,2ml（不同稀釋度）免肝DNA溶液+ 4ml二苯胺試劑沸水浴中精確加熱10’，冷卻用管1做空白對照測該管在595nrn下的光吸收值。根據(jù)DNA的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算所制備的DNA樣品中的DNA含量。,4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果——計(jì)算DAN產(chǎn)率,DNA含量/毫升待測液=標(biāo)準(zhǔn)曲線查得值×稀釋倍數(shù) =xxμg / ml,思 考 題,肝細(xì)胞的勻漿液（含0