細(xì)胞工程理論初級(jí)基礎(chǔ)

1、第三章 細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ),細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)技術(shù) 即是選用各種細(xì)胞的最佳生存條件對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)，是廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)等研究領(lǐng)域的重要技術(shù)。,動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)（cell and tissue culture）是動(dòng)物細(xì)胞工程的重要技術(shù)基礎(chǔ)。動(dòng)物的細(xì)胞與組織培養(yǎng)是指從活的機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，在體外建立無菌、適溫和一定營(yíng)養(yǎng)條件等，使之生長(zhǎng)和生存，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的

2、技術(shù)。,組織培養(yǎng)的概念 組織培養(yǎng)這一名詞實(shí)際上是一個(gè)通用名詞，習(xí)慣上泛指所有的體外培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)物的不同可概括為三個(gè)不同概念：細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。,A：細(xì)胞培養(yǎng)：將組織塊用機(jī)械方法或酶解法分離成單個(gè)細(xì)胞，做成細(xì)胞懸液，再培養(yǎng)于固體基質(zhì)上，成單層細(xì)胞生長(zhǎng)，或在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)培養(yǎng)的技術(shù)稱為細(xì)胞培養(yǎng)。,B：組織培養(yǎng)：將活體的一小片組織放在盛有培養(yǎng)液的玻璃或塑料培養(yǎng)器皿中，待組織塊粘著后，沿底面平面移動(dòng)生長(zhǎng)的過程稱為組織培

3、養(yǎng)。 從組織塊中生長(zhǎng)出來的仍然是細(xì)胞，細(xì)胞在生長(zhǎng)的同時(shí)也發(fā)生移動(dòng)，至使組織培養(yǎng)難以長(zhǎng)時(shí)間維持其原有結(jié)構(gòu)，結(jié)果也就成了細(xì)胞培養(yǎng)。,C：器官培養(yǎng)：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官在體外存活、生長(zhǎng)，并保持其原有結(jié)構(gòu)和功能的培養(yǎng)技術(shù)。,體外培養(yǎng)的種類,二、 細(xì)胞培養(yǎng)的現(xiàn)實(shí)意義,,生物技術(shù)上：生產(chǎn)各種生技術(shù)產(chǎn)品如：狂犬病、小兒麻痹 癥等病毒疫苗，表皮生長(zhǎng)因子及干擾素、白

4、 細(xì)胞介素等生長(zhǎng)因子及單克隆抗體等?？茖W(xué)研究上：在病毒學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)等方面。臨床醫(yī)學(xué)上：胎兒的遺傳性疾病分析，藥物篩選及某些疾 病的治療等,三、細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn),,,,1.研究的對(duì)象是活細(xì)胞 在實(shí)驗(yàn)過程中，根據(jù)要求可始終保持細(xì)胞活力，并可長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)控、檢測(cè)，甚至定量評(píng)估一部分活細(xì)胞的情況，包括活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)等。,,

5、2. 研究條件可以人為控制 可以根據(jù)需要，控制包括pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理、化學(xué)的條件，同時(shí)，可以施加化學(xué)、物理、生物等因素作為條件而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，這些因素同樣可以處于嚴(yán)格控制之下。,3. 研究的樣本可以達(dá)到比較均一性 通過細(xì)胞培養(yǎng)一定代數(shù)后，所得到的細(xì)胞系則可以達(dá)到均一性而屬于同一類型的細(xì)胞，需要時(shí)，可采用克隆化等方法使細(xì)胞達(dá)到純化。,4. 研究?jī)?nèi)容便于觀察、檢測(cè)和記錄

6、采用各種研究技術(shù)、記錄方法： 研究: 倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原 位雜交、同位素標(biāo)記-- 記錄: 攝影照片、縮時(shí)電影、電視--,5.研究的范圍比較廣泛 學(xué)科多： 細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等 對(duì)象廣： 各種動(dòng)物：低等動(dòng)物--高等動(dòng)物--人類 一種動(dòng)物：不同年齡--

7、 不同組織-- 正?；虍惓＃[瘤--）,6.研究的費(fèi)用相對(duì)較經(jīng)濟(jì) 可提供大量、同一時(shí)期、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。,四、細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn),現(xiàn)人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高, 但, 人工所模擬的條件與體內(nèi)實(shí)際情況 仍不完全相同. 當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后, 生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中, 久了，必然發(fā)生變化.,因此，對(duì)于體外培養(yǎng)的細(xì)胞，應(yīng)該把他們視作一種既能保持動(dòng)物體

8、內(nèi)原細(xì)胞一定的性狀、結(jié)構(gòu)和功能，又具有某些改變的，特定的細(xì)胞群體，而不能將之與體內(nèi)的細(xì)胞完全等同。,五、細(xì)胞培養(yǎng)的工作原則,有標(biāo)準(zhǔn)化的工作方法 培養(yǎng)用的液體極多（如培養(yǎng)液、胰蛋白酶、HANKS液及 抗菌素等），應(yīng)由專人負(fù)責(zé)，并保證做到按規(guī)程行事，配制濃度準(zhǔn)確，滅菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要標(biāo)明名稱、濃度、消毒與否和制備日期等。 一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放點(diǎn)，避免雜亂無章，其中尤其重要的是：培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品應(yīng)嚴(yán)格分開，

9、已消毒品與未消毒品應(yīng)分別存放。,第二節(jié) 組織培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué),一、體內(nèi)外細(xì)胞的差異和分化,,（一）體內(nèi)外細(xì)胞的差異 培養(yǎng)細(xì)胞最多見的表現(xiàn)是：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，分化減弱或不顯，出現(xiàn)類似“反祖” 現(xiàn)象；表現(xiàn)為細(xì)胞趨單一化，或獲得不死性，或變成具有惡性性狀的細(xì)胞群。,1.與體內(nèi)主要不同： 相對(duì)孤立、相對(duì)單一 缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié) 和細(xì)胞相互間的影響,2. 主要表現(xiàn) 失去原

10、有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài) 分化減弱或不顯 細(xì)胞趨向單一化； 3. 提示 要正確認(rèn)識(shí)體外培養(yǎng)細(xì)胞 是一種特定條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞群體。,二、培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)分類,體外細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)類型,按生長(zhǎng)方式:2型 粘附型細(xì)胞:附著在某一固相支持物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。 懸浮型細(xì)胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)的細(xì)胞。 絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞，只有少數(shù)細(xì)胞類型如某些腫瘤細(xì)

11、胞和白細(xì)胞可在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)。,體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型,貼附(粘附)型細(xì)胞,粘附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi) 生存和生長(zhǎng)發(fā)育的基本存在方式含義 兩方面結(jié)果 基于粘附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織， 有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須 粘附于一固相表面 才能生存和生長(zhǎng)。,培養(yǎng)時(shí)：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和

12、生長(zhǎng)，因而屬于粘附型細(xì)胞。粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細(xì)胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細(xì)胞,類型 細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式：存在差異 體內(nèi)：粘附是全方位 外形具有復(fù)雜的立體特征 體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面 外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同 按照培養(yǎng)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)時(shí)的主要形態(tài)，可分為幾大類型,分類 根據(jù)形態(tài)大致的不同，主要2類： 上皮細(xì)胞型

13、 成纖維細(xì)胞型 其它，不定型,上皮細(xì)胞型,名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全等于--來源：來源于外胚層，內(nèi)胚層細(xì)胞 如：皮膚及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞 扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核,生長(zhǎng)特點(diǎn) 易相連成

14、片 相靠—緊密相連—成薄層------鋪石狀 生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng) 很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng),體外培養(yǎng)細(xì)胞類型（1）——上皮細(xì)胞型,成纖維細(xì)胞型,名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織 如：真正的成纖維細(xì)胞 心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài) 胞體梭形或不規(guī)

15、則三角形 胞質(zhì)向外伸出2—3個(gè)長(zhǎng)短不等的突起 中有卵圓形核,生長(zhǎng)特點(diǎn)： 排列成放射狀，漩渦狀 并不緊靠連成片， 細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開而 單獨(dú)行動(dòng) 游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞， 常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起,體外培養(yǎng)細(xì)胞類型（2）——成纖維細(xì)胞型,貼附生長(zhǎng)型--類型,1. 與體內(nèi)同名的細(xì)胞不完全相同 如：形態(tài)相似的成纖維細(xì)胞，可不同來源 自同一動(dòng)

16、物不同組織的成纖維樣細(xì)胞相似但 發(fā)展趨向不同2. 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不穩(wěn)定 條件改變，細(xì)胞形態(tài)可有變化,培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定血清 Hela 高血清 低血清 成纖維細(xì)胞樣 上皮樣細(xì)胞 pH Hela 太酸或太堿 標(biāo)準(zhǔn)pH

17、 成纖維細(xì)胞樣 上皮樣細(xì)胞 細(xì)胞密度 3T3 低密度 高密度 成纖維細(xì)胞樣 上皮樣細(xì)胞 生長(zhǎng)狀態(tài)改變 懸浮或貼附 懸浮 貼附 圓形 成纖維或上皮樣

18、轉(zhuǎn)化與否 未轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化后 成纖維樣 可成上皮樣,懸浮生長(zhǎng)型,概念 培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng) 或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)來源 自血，脾或骨髓， 尤以血中白細(xì)胞 癌腫細(xì)胞也可能特點(diǎn) 在懸浮中生長(zhǎng)良好

19、 細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán),優(yōu)點(diǎn) 生存空間大，提供數(shù)量大 傳代方便(不需消化) 易于收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn) 觀察不方便 很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)(尤以正常細(xì)胞),懸浮型,概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)來源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞特點(diǎn)：在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，　　　易于收獲，可獲

20、得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)(尤以正常細(xì)　　　胞),HL-60 分化細(xì)胞Giemsa染色1. 細(xì)胞種類：HL-60； 2. 培養(yǎng)的天數(shù)：ATRA 1微摩爾作用5天；3. 放大倍速：倒置顯微鏡 X10；4. 培養(yǎng)基種類：1640+8％胎牛血清；5. 細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：懸浮細(xì)胞，分化的細(xì)胞核漿比例減小，核仁減少或 消失，胞核呈桿狀或分葉狀。,KU8121.細(xì)胞種類：人嗜堿細(xì)胞性白血病細(xì)胞系；

21、2.培養(yǎng)的天數(shù)：5d；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X20；4.培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%新生牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈圓形，懸浮生長(zhǎng)。,HeLa細(xì)胞1.細(xì)胞種類：人HeLa細(xì)胞傳代培養(yǎng)；2.培養(yǎng)的天數(shù)：7d；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X200；4.培養(yǎng)基種類：DMEM+10%小牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈多角形，貼壁生長(zhǎng)。,K562細(xì)胞1.細(xì)胞種類：K562（人慢性紅白血病細(xì)胞株）；

22、2.培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后2天；3.放大倍數(shù)：倒置顯微鏡 X10；4.培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%胎牛血清，4mM Glutamine；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)介：懸浮生長(zhǎng)，少數(shù)貼壁，喜愛成團(tuán)懸浮。,三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn),,,,（一）貼附,（二）接觸抑制,（三）密度抑制,四、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過程,（一）組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期(Life Span of Culture Cells),培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)

23、的時(shí)間。包括原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期及衰退期。,,正常培養(yǎng)的細(xì)胞周期,游離期 懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形。吸附期 貼附底物，一般24小時(shí)內(nèi)貼壁。潛伏期 此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，基本無增殖。 細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn) 行實(shí)驗(yàn)研究。停止期（平臺(tái)期） 細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂

24、 機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性,原代培養(yǎng)(Primary Culture)期,也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。,,特點(diǎn)：細(xì)胞呈活躍移動(dòng)，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。與 體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。,傳代期,特點(diǎn)：在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，細(xì)胞增殖旺 盛，并能維持二倍體核型。,傳代：體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)

25、細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營(yíng)養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營(yíng)養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代。初代培養(yǎng)的細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（Cell Line）。,衰退期特點(diǎn)：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖， 最后衰退凋亡。,（二）體外培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期,潛伏期指數(shù)增生期停滯期,所謂細(xì)胞的“一代”是指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一

26、段時(shí)間。,（三）單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程,（四） 、體外培養(yǎng)細(xì)胞的遺傳學(xué)特征,（1）核型變化,（2）永生化和惡變,（3）細(xì)胞性別,（五） 、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境,（一）無污染環(huán)境,（二）溫度,（三）氣體環(huán)境和氫離子濃度,（六） 、體外培養(yǎng)細(xì)胞生存所需基本物質(zhì),（1）糖,（2）氨基酸,（3）維生素,（4）促生長(zhǎng)因子,（5）其它物質(zhì),,（七） 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇,細(xì)胞深低溫保存的基本原理是： 在－70℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處

27、于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長(zhǎng)期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵： 在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。,,,凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融,慢凍程序 4 ℃ 10 分鐘 －20 ℃ 30 分鐘 －80 ℃ 16 - 18 小時(shí)(或隔夜) 液氮罐長(zhǎng)期儲(chǔ)存。,凍存管1.2ml 2ml，5ml,液氮罐,,,細(xì)胞復(fù)蘇方法,（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～

28、 38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）；（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上；（3）低速離心10分鐘；（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。,,,低溫保護(hù)劑的應(yīng)用,在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑。也有用甘油的凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基 10% DMSO（或10％甘油） DMSO液用培養(yǎng)液配好，避

29、免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞。,細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞濃度應(yīng)該多少？,冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1×106 cells/ml 融合瘤細(xì)胞則以5×106 cells/ml 為宜。,細(xì)胞的運(yùn)輸技術(shù),（八）細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè),細(xì)胞污染的種類: 細(xì)菌、酵母菌、霉菌和病毒污染源 : 無菌操作技術(shù)不當(dāng); 操作室環(huán)境不佳; 污染之血清; 污染之細(xì)胞 .,細(xì)菌培養(yǎng)液被洋蔥佰克霍爾德菌污染了。洋蔥佰

30、克霍爾德菌（Burkholderiacepacia）原屬假單胞菌屬，是植物病原菌。,白色念珠菌污染,真菌感染,支原體污染電鏡照片, 煎蛋狀和其他形狀,,細(xì)菌和真菌的污染和檢測(cè),肉眼直接觀察法培養(yǎng)檢查法顯微鏡觀察法,Ⅱ. 支原體的污染和檢測(cè),Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法DNA熒光染色法PCR方法相差顯微鏡觀察法測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)， 應(yīng)直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。,病毒的污染和檢測(cè),細(xì)胞的直接觀察動(dòng)物接種

31、檢查電子顯微鏡觀察免疫學(xué)檢查PCR技術(shù),第三節(jié) 建立細(xì)胞系或細(xì)胞株,一、體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類和命名,（一）初代培養(yǎng) (原代培養(yǎng)) 初代培養(yǎng)又稱原代培養(yǎng)，即直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。 一旦已進(jìn)行傳代培養(yǎng)(subculture)的細(xì)胞，便不再稱為初代培養(yǎng)，而改稱為細(xì)胞系。,原代培養(yǎng),直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞進(jìn)行的第一次培養(yǎng)物。優(yōu)點(diǎn)： 組織細(xì)胞剛脫離機(jī)體，生物性狀尚未

32、發(fā)生較大變化，在一定程度上能夠反映體內(nèi)的狀態(tài)。,大鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)1.細(xì)胞種類：大鼠原代肝細(xì)胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：剛分離，未經(jīng)培養(yǎng)； 細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：剛分離時(shí)球形透亮，貼壁 后呈不規(guī)則。,(二）傳代培養(yǎng),將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞在生長(zhǎng)、繁殖一定時(shí)間后，由于空間不足或細(xì)胞密度過大導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)枯竭，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此需要進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，即傳代或稱為傳代培養(yǎng)。,HepG2細(xì)胞

33、 細(xì)胞種類：人肝腫瘤細(xì)胞； 培養(yǎng)的天數(shù)：傳代培養(yǎng)2天； 細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：呈多角型、不規(guī)則 貼壁生長(zhǎng)，成團(tuán)聚集。,根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種：1．懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新 培養(yǎng)液后再混勻傳代。 2．半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞） 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用 直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。

34、3．貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。 常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。,細(xì)胞傳代方法,首次傳代注意事項(xiàng),細(xì)胞生長(zhǎng)密度不高時(shí)，不能急于傳代 ；原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時(shí)間 ；吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機(jī)械損傷 ；首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些 ；首次傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些 ；小牛血清濃度可加大至15%～20%左右 。,細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同血細(xì)胞計(jì)數(shù)器

35、：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞Coulter計(jì)數(shù)儀：人工計(jì)數(shù),細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟,1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板 上。2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿 蓋片和計(jì)數(shù)板之間?！?、靜置3分鐘。4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)。 　　細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×104注意：壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。 鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按

36、單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。,培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定,細(xì)胞活力： 總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。,測(cè)定方法,臺(tái)盼藍(lán)法 活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。流式細(xì)胞儀 細(xì)胞活性指標(biāo)通常包括細(xì)胞膜對(duì)核酸染料的通透性，代謝活性，膜電位等。,四唑鹽（MTT）比色法,四唑鹽（MTT

37、）商品名為噻唑藍(lán)；MTT比色法的原理： 活細(xì)胞中琥珀脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臢 （formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。 二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm處產(chǎn)生吸收值，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值；,傳代注意事項(xiàng),接種數(shù)量為5×104～8×105個(gè)/ml 傳代密度

38、太低，細(xì)胞容易死亡，表現(xiàn)出細(xì)胞在達(dá)到增長(zhǎng)前有較長(zhǎng)的滯留期。培養(yǎng)液由于pH下降而呈現(xiàn)黃色，表明細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到最大密度需要換液或進(jìn)行傳代培養(yǎng)。如果是單層貼壁的細(xì)胞，等長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶表面，即可進(jìn)行傳代。,細(xì)胞系（Cell Line）,培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞有限細(xì)胞系（Finite Cell Line）連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系（Infinite Cell Line）腫瘤細(xì)胞系或株我國(guó)已建細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。 腫瘤細(xì)

39、胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞 具有不死性和異體接種致瘤性。,細(xì)胞株,細(xì)胞株: 用單細(xì)胞分離培養(yǎng)增殖形成的具特定生長(zhǎng)特性的細(xì)胞群。再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株。,克隆細(xì)胞株 從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選購(gòu)方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。,細(xì)胞培養(yǎng)板 6孔，12孔，24孔，48孔96孔

40、,二倍體細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞染色體數(shù)目具有與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同(2n細(xì)胞占75＞或80％以上)的細(xì)胞群，稱二倍體細(xì)胞培養(yǎng)。二倍體細(xì)胞在正常情況下具有限生命期，故屬有限細(xì)胞系。,腫瘤細(xì)胞系或株,是現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類，我國(guó)已建立細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈上皮細(xì)胞型，常已傳幾十代或百代以上，并并具有不死性和異體接種致瘤性。,對(duì)已建成的各種細(xì)胞系或細(xì)胞株習(xí)慣上都給以名稱；細(xì)胞的命名無嚴(yán)格統(tǒng)一規(guī)定，大多

41、采用有一定意義縮寫字或代號(hào)表示。但不論什么形式，均不宜太長(zhǎng)，以便記憶和了解，今列舉以下幾種代表性的細(xì)胞名稱供參考； HeLa： 為供體患者的性名(來源于宮頸癌) CHO： 中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary) 宮—743：宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立 NIH3T3：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所(National Institute of

42、 Health)建立, 每3天傳代一次，每次接種 3×106細(xì)胞／毫升。,細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名,二、建立細(xì)胞系（或株）的要求,（一）組織來源（二）細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)（三）培養(yǎng)條件和方法,何處購(gòu)買細(xì)胞,ATCC（American Type Culture Collection ） 細(xì)胞庫(kù)(www.atcc.org).美國(guó)菌種保藏中心又稱美國(guó)模式

43、菌種收集中心(ATCC)是位于馬里蘭洲洛克菲勒的一家私營(yíng)的，非贏利性組織。目前它可以提供以下物品 細(xì)胞系3000種 細(xì)菌和噬菌體 15000種 動(dòng)植物病毒 2500種 原生動(dòng)物 1200種以及重組物品 歐洲動(dòng)物細(xì)胞庫(kù)(ECACC)和日本細(xì)胞庫(kù)(RCB),國(guó)內(nèi)細(xì)胞庫(kù),中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心聯(lián)系方法：地址：上海市岳陽路320號(hào)，200031電話：021-54

44、920404， 54920405Fax: 021-54920406聯(lián)系人：陳松華，徐惠均e-mail: shchen@sibs.ac.cn,http://sub.whu.edu.cn/cctcc/fzlbc/pywml.htm中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 也稱武漢大學(xué)保藏中心，是國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的專利培養(yǎng)物/生物材料／菌種保藏機(jī)構(gòu),訂購(gòu)程序,向中心訂購(gòu)培養(yǎng)物，可查閱CCTCC培養(yǎng)物目錄，并向CCTCC提出訂購(gòu)培養(yǎng)物的名稱、

45、CCTCC保藏號(hào)等內(nèi)容。聯(lián)系方式可通過電話、傳真，信函，電子郵件等方式。 電話：027-87682319 傳真：027-87883833 E-mail:cctcc@whu.edu.cn細(xì)胞系：300～500元/每株 菌種準(zhǔn)備時(shí)間 一般情況CCTCC收到訂購(gòu)人的匯款后的3-4天寄出，每周寄送二次（周一，周五）。,三、已建立細(xì)胞系或株的簽定、管理和使用,培 養(yǎng) 簡(jiǎn) 歷：組織來源日期、物種、組織起源、性

46、別、年齡、 供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等。凍 存 液：培養(yǎng)基和防凍液名稱。細(xì) 胞 活 力：融解前后細(xì)胞接種存活率和生長(zhǎng)特性。培 養(yǎng) 液：培養(yǎng)基種類和名稱(一般要求不含抗生素)，血 清來源和含量。細(xì) 胞 形 態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細(xì)胞等。核 型：二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體