dna序列測(cè)定課件

1、第八章 DNA序列測(cè)定,王 文 君,廣州中醫(yī)藥大學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室免疫研究室,自然界中物種(生物)的豐富多樣性是由其生命本質(zhì)決定的，物種的本質(zhì)特征的多樣性首先體現(xiàn)在其DNA序列的多樣性(病毒為RNA)，這種千差萬(wàn)別的DNA序列正是自然界中形態(tài)和功能各異的物種的基石。我們要了解各物種的本質(zhì)特征，就必需從其DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)上開(kāi)始。因?yàn)槠銬NA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是各物種生理功能的基礎(chǔ)，也是我們對(duì)其進(jìn)行深入研究的出發(fā)點(diǎn)。,DNA是物種生存和發(fā)展

2、的基石,一、物種的生存 DNA→RNA→多肽,,二、物種的繁衍,DNA,DNA,DNA,DNA,DNA,DNA,DNA,,,,,,,測(cè) 序 方 法DNA序列測(cè)定是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的?？煞蛛x相差僅1個(gè)堿基的300～500bp的核酸分子。一.雙脫氧末端終止法二.化學(xué)裂解法三.基因芯片法,1977年，Sanger在加減法基礎(chǔ)上提出了雙脫氧末端終止法測(cè)序，其原理如下： 四個(gè)反應(yīng)

3、管中，在DNA聚合酶催化下，以單鏈DNA為模板，加入單引物、四種dNTP，以及每管中加入雙脫氧核糖核苷酸ddA、ddT、ddG、ddC。雙脫氧核苷酸(ddNTP)的5’端-OH是正常的，而其3’端-OH則沒(méi)有，因此能與引物延伸鏈的3’端連接，而不能連接其后繼核苷酸，于是引物鏈的延伸至此結(jié)束，經(jīng)過(guò)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，根據(jù)電泳圖譜即可拼出所測(cè)DNA序列（即DNA的核苷酸順序）。,,,,,A反應(yīng),G反應(yīng),T反應(yīng),C反應(yīng),DNA聚合酶M

4、g離子DNA模板引物 dNTPsddATP,DNA聚合酶Mg離子DNA模板引物 dNTPsddGTP,DNA聚合酶Mg離子DNA模板引物 dNTPsddTTP,DNA聚合酶Mg離子DNA模板引物 dNTPsddCTP,,,,,,O,,堿基G、C、A、T,,C,,O,,HPO,,OH,脫氧核糖核苷酸(dNTP)的分子結(jié)構(gòu)式,1’,2’,3’,4’,5’,P,,,,,,,,,,O,堿基G、C、A、T,C

5、,,HPO—,雙脫氧核糖核苷酸(ddNTP)的分子結(jié)構(gòu)式,1’,2’,3’,4’,5’,O,核苷酸鏈?zhǔn)疽鈭D,末端終止法圖解,正常,雙脫氧ddNTP,3`—ATTGCGATCTAGTGGCTAATG—5`,CGCTAGATCACCGATTAC,5`—TAA,3`—ATTGCGATCTAGTGGCTAATG—5`,5`—TAA,CGCTA,5`—TAA,CGCTAG,5`—TAA,5`—TAA,5`—TAA,5`—TAA,CGCTAGA,

6、CGCTAGAT,CGCTAGATC,CGCTAGATCA,5`—TAA,5`—TAA,CGCTAGATCAC,CGCTAGATCACC,末端終止法測(cè)序步驟,一.測(cè)序DNA模板制備二.四種反應(yīng)液的準(zhǔn)備三.引物與模板退火四.延伸反應(yīng)五.電泳六.讀序,DNA測(cè)序方法,末端終止法：最常用。化學(xué)裂解法：研究DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)的相互作用。雜交測(cè)序法：DNA多態(tài)性分析。,一. 測(cè)序模板的制備,測(cè)序可分為單鏈測(cè)序與雙鏈測(cè)序，

7、對(duì)于未知序列可采用單鏈測(cè)序，而對(duì)于已知DNA序列可采用雙鏈測(cè)序。但不管單鏈測(cè)序還是雙鏈測(cè)序，其測(cè)序反應(yīng)都一樣。 其中單鏈模板可通過(guò)將待測(cè)DNA片段克隆到噬菌體M13中或通過(guò)不對(duì)稱(chēng)PCR制備 ；雙鏈模板可通過(guò)將待測(cè)DNA片段克隆到質(zhì)粒DNA中或通過(guò)PCR擴(kuò)增制備。所得模板DNA應(yīng)通過(guò)純化處理才能用于后繼測(cè)序反應(yīng)。,二. 測(cè)序引物的設(shè)計(jì),測(cè)序所用引物一般采用通用引物，也可根據(jù)已有序列設(shè)計(jì)引物，引物一般有15～30個(gè)堿基，應(yīng)遵循一般

8、引物設(shè)計(jì)原則。 引物設(shè)計(jì)原則： 1、G+C含量為45～55%。 2、3端最好以A或C結(jié)尾，不要以T結(jié)尾。 3、引物長(zhǎng)度以15～30bp為宜。 4、引物本身不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。,三. 四種測(cè)序反應(yīng)液的制備,測(cè)序反應(yīng)液組成：反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶、Mgcl2、引物、純水、四種dNTP，分別在四個(gè)反應(yīng)管中加入一種相應(yīng)ddNTP。標(biāo)記物：測(cè)序反應(yīng)的標(biāo)記物有核素和熒光染料。標(biāo)記載體有引物、dNTP

9、、ddNTP?，F(xiàn)在應(yīng)用較多的是將熒光染料標(biāo)記于引物或ddNTP上，因核素對(duì)環(huán)境的污染而逐漸應(yīng)用得比較少。但也可以不進(jìn)行標(biāo)記而采用銀染系統(tǒng)檢測(cè)。,四. 延伸反應(yīng),引物在DNA聚合酶的催化下，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則逐步在引物的3’端加上四種脫氧核糖核苷酸。四個(gè)反應(yīng)管中的ddNTP隨機(jī)地與dNTP竟?fàn)幗Y(jié)合位點(diǎn)，于是引物延伸鏈隨機(jī)終止在各個(gè)可能位點(diǎn)，形成一系列相差一個(gè)核苷酸的單鏈DNA分子。,五.電泳與讀序,反應(yīng)產(chǎn)物與甲酰胺混和，并高溫加熱變性

10、后，于變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。對(duì)于沒(méi)有標(biāo)記的測(cè)序反應(yīng)，電泳完成后可用銀染將DNA標(biāo)記、拍照、讀序。對(duì)于用核素標(biāo)記的測(cè)序反應(yīng)，按核素操作規(guī)程拍照。對(duì)于用熒光染料標(biāo)記的測(cè)序反應(yīng)，現(xiàn)有一些商業(yè)生物技術(shù)公司開(kāi)發(fā)的測(cè)序儀可在電泳過(guò)程中進(jìn)行檢測(cè)。,末端終止法圖示,ACGTTGCACGTA,,,,,,A反應(yīng)管AACGTTGCAACGTTGCACGTA,C反應(yīng)管ACACGTTGCACGTTGCAC,G反應(yīng)管ACGACGTTG

11、ACGTTGCACG,T反應(yīng)管ACGTACGTTACGTTGCACGT,TGCAACGTGCAT,T泳道,,化 學(xué) 裂 解 法,首先對(duì)待測(cè)DNA單鏈單側(cè)末端進(jìn)行放射性標(biāo)記，再分成4～5個(gè)反應(yīng)體系，分別用不同的化學(xué)試劑處理，DNA片段分別于某一種或某一類(lèi)堿基處斷裂，而斷裂的堿基隨機(jī)發(fā)生于DNA片段上某種或某類(lèi)堿基中的任何一個(gè),且每一個(gè)DNA分子只有一處斷裂點(diǎn)。電泳后，放射自顯影得到相互錯(cuò)落的梯形圖譜，即可讀出DNA序列。,化學(xué)測(cè)序

12、反應(yīng)機(jī)理,G反應(yīng)：硫酸二甲脂(DMS)使鳥(niǎo)嘌呤N7甲基化。A+G反應(yīng)：甲酸使嘌呤環(huán)的氮質(zhì)子化而使糖苷鍵被削弱，進(jìn)而嘌呤環(huán)被吡啶取代。C+T反應(yīng)：肼裂解嘧啶環(huán)，導(dǎo)致其脫落。C反應(yīng)：在一定濃度的NaCl存在時(shí)，肼只對(duì)胞嘧啶起作用。 以上反應(yīng)完成后，吡啶在加熱條件下導(dǎo)致被修飾堿基處磷酸二酯鍵斷裂。,化學(xué)測(cè)序法操作步驟,1.待測(cè)單鏈DNA的純化和標(biāo)記2.堿基的特異性修飾3.堿基的裂解4.上樣電泳5.測(cè)序圖譜識(shí)讀,5’

13、 *p GATCGGACCT 3’,G反應(yīng),G+A反應(yīng),T+C反應(yīng),C反應(yīng),,*GATCGGACCT*GATCGGACC*GATCGGAC*GATCGGA*GATCGG*GATCG*GATC*GAT*GA*G,,,,,,,,,,,,,,,,,化學(xué)裂解法的特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：1、所測(cè)序列直接來(lái)源于所測(cè)DNA，避免了DNA復(fù)制中錯(cuò)誤dNTP的摻入。2、可直接對(duì)合成的寡核苷酸測(cè)序，可分析甲基化修飾等，以及研究DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)及

14、蛋白質(zhì)與DNA的相互作用等。缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，讀序困難。,雜 交 測(cè) 序,雜交測(cè)序是以基因芯片為基礎(chǔ)的一種測(cè)序方法，將一段DNA片段分解為一系列相差一個(gè)堿基的八聚體，將這些八聚體做成基因芯片與待測(cè)DNA雜交，根據(jù)雜交結(jié)果拼湊出所測(cè)DNA序列。,雜交測(cè)序詳解,TCACGATCCTTAGGCAC 測(cè)序模板AGTGCTAG GTGCTAGG TGCTAGGA GCTAGGAA

15、CTAGGAAT TAGGAATC AGGAATCC GGAATCCG GAATCCGT AATCCGTG,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Genechip,基 因 芯 片,Applied Biosystem

16、公司 310 型遺傳分析儀介紹,ABI公司專(zhuān)業(yè)生產(chǎn)各種PCR儀和電泳儀，本次所介紹的ABI PRISM 310遺傳分析儀為ABI公司生產(chǎn)的單毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，由電泳系統(tǒng)、激光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)等組成。能用于基因掃描、DNA測(cè)序分析等。,基因掃描 (Gene Scan),基因掃描可用于檢測(cè)待測(cè)物種的有無(wú)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、基因突變等檢測(cè)。,DNA測(cè)序分析,ABI PRISM 310遺傳分析儀可用于DNA測(cè)序分析，四

17、種雙脫氧核苷酸堿基帶有四種不同的熒光染料，利用雙脫氧末端終止法測(cè)序。經(jīng)過(guò)一根盛有變性聚丙烯酰胺凝膠的毛細(xì)管電泳，長(zhǎng)短不同的DNA片段依次通過(guò)激光檢測(cè)窗口，由CCD攝像機(jī)收集熒光信號(hào)，再由機(jī)算機(jī)測(cè)序分析軟件對(duì)所收集的信號(hào)進(jìn)行分析。 測(cè)序速度高達(dá)200bp/小時(shí)，一個(gè)樣品一次可測(cè)定700多個(gè)堿基。,,激光,,,,,CCD攝像機(jī),,,,,,,,,,ddATP,,,ddTTP,,ddGTP,,ddCTP,DNA測(cè)序儀的應(yīng)用,1、基因組測(cè)序

18、2、基因突變分析3、基因連鎖圖譜和指紋圖譜4、基因表達(dá)5、疾病的基因診斷,DNA測(cè)序檢測(cè),亨廷頓病(Huntington’s disease，HD) 亨廷頓病是以神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變?yōu)橹饕卣鞯某Ｈ旧w顯性遺傳病。1993年發(fā)現(xiàn)HD基因，并揭示IT15基因的不穩(wěn)定突變，即IT15基因5’端編碼區(qū)CAG三個(gè)核苷酸的異常擴(kuò)展性重復(fù)是HD的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。,病例來(lái)源：江蘇徐州HD家系 ：7例患者，30例HD風(fēng)險(xiǎn)者。浙江慈溪H

19、D家系：1例患者，9例HD風(fēng)險(xiǎn)者提取受檢者外周血白細(xì)胞基因組DNA，先進(jìn)行PCR擴(kuò)增IT15基因，接著進(jìn)行DNA測(cè)序反應(yīng)，,檢 測(cè) 結(jié) 果 IT15基因在正常人中其(CAG)的重復(fù)數(shù)呈多態(tài)性，其拷貝數(shù)在13~26之間。 HD的IT15基因的(CAG)拷貝數(shù)均大于40，大多數(shù)為45~50。,亨廷頓病發(fā)病預(yù)測(cè) IT基因的(CAG)拷貝數(shù)的多少與亨廷頓病的發(fā)病年齡呈正相關(guān)，(CAG)拷貝數(shù)在45~50時(shí)，

20、發(fā)病年齡為40歲左右；(CAG)拷貝數(shù)在50以上時(shí)，其發(fā)病年齡在20~30歲之間。,亨廷頓病的發(fā)病機(jī)制 亨廷頓病是由IT基因的(CAG)重復(fù)序列的重復(fù)數(shù)太多引起的，CAG可編碼谷氨酰胺，由于CAG的重復(fù)數(shù)太多，則由CAG編碼的谷氨酰胺在IT基因編碼的蛋白質(zhì)中大量積累，從而影響蛋白質(zhì)的正常功能。,DNA測(cè)序在亨廷頓病中的應(yīng)用 根據(jù)亨廷頓病的發(fā)病機(jī)制，可以利用DNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行亨廷頓病的預(yù)測(cè)和診斷。可抽取羊水細(xì)胞，提取其

21、DNA后，用PCR擴(kuò)增IT基因的目地片段進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)其(CAG)拷貝數(shù)的多少，根據(jù)CAG重復(fù)數(shù)的多少預(yù)測(cè)胎兒出生后患HD的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)，決定是否終止妊娠。,乙型血友病的DNA測(cè)序檢測(cè)血友病可分為甲型血友病和乙型血友病兩種血友病的臨床癥狀相似，出血部位為肌肉、關(guān)節(jié)及深部組織，直到1952年才用凝血活酶生成實(shí)驗(yàn)(TGT)及部分凝血活酶時(shí)間(PTT)測(cè)定實(shí)驗(yàn)將兩種血友病分開(kāi)。,,,,Y X正常男性,,,Y X血友病

22、男性,,,,,,,,,,,,,,X X正常女性,X X血友病女性,X X攜帶者女性,,正?；?,血友病基因,目前研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致乙型血友病發(fā)生的FⅨ基因功能障礙的基因突變種類(lèi)繁多，大約有400種左右，由于乙型血友病基因較小，對(duì)乙型血友病可以測(cè)定基因的序列作出診斷。,從36例乙型血友病患者中共檢出17位女性為突變基因攜帶者。檢測(cè)出女性攜帶者后，可對(duì)該婦女開(kāi)展產(chǎn)前診斷，如果發(fā)現(xiàn)了胎兒為血友病患者或血