（ngs）dna序列分析技術(shù)-thermofisherscientific

1、,孫宏鈺中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系,法庭科學(xué)新技術(shù)應(yīng)用高峰論壇（2016年11月17日佛山）,NGS-STR分型在個體識別和親子鑒定中的應(yīng)用初探,前 言,,Part I,,基于CE平臺的PCR-STR檢測是現(xiàn)階段法醫(yī)DNA實驗室的金標(biāo)準(zhǔn)Forensic DNA CaseworkDNA DatabasesMass DisastersMissing PersonsParentage and Kinship Testing

2、Genetic Genealogy & Answering Historical QuestionsAuthenticating Human Cell LinesMonitoring Transplants……更多Loci組合的有限性長度多態(tài)性檢測：未充分利用遺傳標(biāo)記信息,法醫(yī)STR分型,,,中國法庭DNA數(shù)據(jù)庫已有3877.1（4400）萬條數(shù)據(jù)已認(rèn)定比中391.9萬次現(xiàn)場生物物證入庫比中率35.34%,,,DN

3、A序列分析技術(shù)—下一代測序（NGS）,DNA序列分析技術(shù)—下一代測序（NGS）,,,,Massively parallel sequencing (MPS),DNA序列分析技術(shù)—下一代測序（NGS）,,,,,,基于NGS平臺的法醫(yī)STR分型,,,長度多態(tài)性 序列多態(tài)性,,材料和方法,,Part II,實驗材料,,,樣本：42個廣東漢族個體血痕樣本（3.0mm血

4、片）包含14個父母子二代家系已采用Goldeye 20A體系進行19個STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴增和毛細(xì)管電泳檢測，每個家系都包含1～2個STR突變位點陽性對照：007 (Thermo Fisher)9947A (Promega),實驗方法,,,DNA提取：AutoMate ExpressTM自動化提取系統(tǒng)PrepFiler® BTA Forensic DNA Extraction KitQubit®

5、;3.0定量 DNA濃度,實驗方法,,,文庫構(gòu)建：樣本文庫構(gòu)建Early Access STR Kit （24個STR基因座）11個CODIS核心位點： CSF1PO, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D21S11, TH01, TPOX, vWA5個CODIS補充核心位點： D1S1656, D2S1338, D2S441, D10S1248, D19S4

6、338個非CODIS核心位點： D14S1434, D1S1677, D2S1776, D4S2408, D5S2500, D6S1043, D6S474, D9S2157樣本文庫純化磁珠 Agencourt® AMPure® XP Reagent (Beckman Coulter),實驗方法,,,模板制備：文庫定量 qPCR定量到40-60pM乳化PCR Ion PGM? Hi?Q? Chef K

7、it（Thermo Fisher）陽性珠子的富集,Ion Chef,實驗方法,,,測序反應(yīng)：半導(dǎo)體測序ION PGM? Hi-Q? Sequencing Kit（Thermo Fisher）Ion 318? 芯片：1GIon 316? 芯片：100M,Ion PGM,通過檢測pH值變化來進行測序，直接將化學(xué)信號轉(zhuǎn)換為電信號。,實驗方法,,,數(shù)據(jù)分析：PGM測序數(shù)據(jù)分析HID STR Genotyper Plugin v3.

8、1 BAM 文件用IGV_2.3.72分析FASTQ文件用STRait Razor v2.6分析PGM分型數(shù)據(jù)和CE分型數(shù)據(jù)比較PGM家系數(shù)據(jù)分析,實驗結(jié)果和討論,,Part III,分型結(jié)果,NGS-STR基因座分型,,,,所有樣本的分型結(jié)果總覽,,,等位基因的核心序列簡式,等位基因及其Stutter峰圖,分型結(jié)果輸出格式,NGS-STR基因座分型,,,分型結(jié)果輸出格式,NGS-STR基因座分型,,,PGM檢測平臺的STR

9、基因座分型,,,陽性對照結(jié)果,測序覆蓋深度（ depth of coverage, DoC）,NGS-STR檢測的數(shù)據(jù)質(zhì)量,,,PGM檢測平臺的數(shù)據(jù)質(zhì)量,,,Stutter占主峰的峰面積比：,Stutter出現(xiàn)比率：,等位基因的雜合峰高比,PGM檢測平臺的數(shù)據(jù)質(zhì)量,,,CE和NGS平臺的STR分型一致性：42個樣本和2個陽性對照DNA樣本（9947A，007），共1232個等位基因，分型一致率為98.13%。不一致原因分析等位基

10、因丟失D21S11基因座X.1、X.2、X.3結(jié)構(gòu)多一個重復(fù)單位,,,各個基因座的等位基因個數(shù),等位基因（Isoallele）,,,,,等位基因（Isoallele）,,Goldeneye 20A和Early Access STR Kit重疊基因座共14個：CSF1PO, D2S1338, D3S1358, D5S818, D6S1043, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D19S433, D

11、21S11, TH01, TPOX and vWA14個三聯(lián)體二代家系：3個：母源突變（其中2個是多步突變）3個：父源突變3個：突變來源不明3個：有突變，但未涵蓋在重合的14個基因座中,親子鑒定,,,,小 結(jié),,Part IV,NGS-STR分型的優(yōu)點,,,,檢測序列多態(tài)性——信息更充分利用，提高多態(tài)性；可組合的STR基因座的個數(shù)不受熒光種類限制；每個STR基因座的擴增片段長度不受熒光組合限制；對等位基因親本來源的識別