病理切片技術(shù)

1、病理切片技術(shù),,寧波明州醫(yī)院病理科主講人：周曉龍2016年2月17號,石蠟切片,以石蠟制作的切片，可以制成極薄的切片。一般的切片厚度要求在4—6微米，而石蠟切片不但可以達到這個要求，甚至可以切得更薄到2微米以至1微米。另外，石蠟切片還便于制作大批的或是連續(xù)的切片，而且以石蠟包埋的組織塊便于長期保存，所以石蠟切片是目前各種切片制作方法中最普遍常用的一種方法。,切片機,切片機的基本類型有五種，按其結(jié)構(gòu)叫做： （1）搖動式切片機，（2）

2、輪轉(zhuǎn)式切片機，（3）滑動式切片機，（4）推動式（雪橇式）切片機，（5）冰凍切片機。最常用的是輪轉(zhuǎn)式切片機。,切片機,,切片機,輪轉(zhuǎn)式切片機：系借轉(zhuǎn)動手搖輪進行切片動作。是靠旋轉(zhuǎn)一個重輪，帶動螺紋軸或齒輪，將組織塊夾具向前推進，并在上下平面擺動；推動的距離靠一個有刻度的調(diào)節(jié)器控制，每一梯度為1或2微米。,切片前的準備,恒溫水浴鍋首先預熱至35℃—40℃。蠟塊整修，將蠟塊組織面的石蠟用刀修去，使組織全部暴露出切面并修平，以減少切片刀的

3、磨損。 將鋒利的刀片裝入切片刀夾鉗內(nèi)，調(diào)整角度和位置后隨即緊固，檢查切片刀的傾斜度是否正確，傾角過大、則切片上卷；傾角過小則切片皺起，以20°-30°為佳。準備好載玻片、小型毛筆、小型無鉤鑷子、鉛筆。,切片的步驟,將蠟塊固定于切片機頭上的夾座內(nèi)，調(diào)整到稍離開切片能夠切到的位置上，注意蠟塊組織切面與切片刀口要垂直平行。再調(diào)整蠟塊組織切面恰好與刀口接觸，旋緊刀架，固定好機頭。根據(jù)需要調(diào)整切片厚度。搖動切片

4、機手輪先進行修整切片，直到切出完整的最大組織切面后，再進行切制。,切片的步驟,實踐中可用右手轉(zhuǎn)動切片機手輪，左手用毛筆托起蠟片，協(xié)調(diào)地進行切片操作。切下的切片帶，一端用鑷子輕輕拉起，應盡可能將切片帶拉直展開，用毛筆將切片帶從刀口向上挑起，拉下切片帶，然后輕拖鋪于恒溫水面上。將單張或數(shù)張切片，用鑷子夾住蠟片的一邊并提起，鋪于恒溫水中（光亮的一面朝下），立即用毛筆輕輕拉展，以切片無皺褶為最好。如有皺褶時用鑷子細心地逐個輕輕撥開，注意不可

5、撥破組織。然后分開每張切片，選取其中最完整的，沒有皺褶的切片。,貼片（撈片）,待切片在恒溫水內(nèi)充分攤開展平后，將載玻片垂直插入水中，以做過防脫處理的一面輕靠切片，將玻片直立提起，趁玻片上仍有少量水份時用毛筆，撥正切片位置。如組織較小，可在玻片上多貼幾片或幾排，但排列應密集、整齊。,烤片,用鉛筆在玻片一端的毛玻璃上寫上標本編號，字要寫得小而清楚、端正。將附貼好的切片置于60℃恒溫箱內(nèi)干燥2-8小時，使切片牢固地貼附于載玻片上即可進行染

6、色。,切片的注意事項,切片質(zhì)量的好壞，除與技術(shù)熟練程度和切片機的好壞有關(guān)外，切片刀是決定的因素，刀一定要磨得十分鋒利。否則在切片時會自行卷起或皺起，或?qū)⒔M織劃傷出現(xiàn)刀痕，更不能順利地將切片切成連續(xù)地長條帶狀。切片刀如有缺口存在，將使制成的切片斷裂、破碎，不完整，切片時應時時擦凈刀口。切片機的各個零件和螺絲應旋緊，否則將會產(chǎn)生震動。在切制切片的開頭階段如出現(xiàn)切制不良與其他故障，最常見的原因是蠟塊或切片刀的松動所致。搖動切片機時，用力要

7、求均勻一致，不宜過重過猛，否則可因用力過重而使機身震動，造成切片厚薄不均。遇有硬化過度的腦、肝、脾等組織時，應該輕輕切削，以防組織由于震動形成空洞現(xiàn)象。在夏秋季節(jié)進行切片時，應使用冰塊加強冷卻，這樣不僅可保持石蠟的硬度，同時也減少了切片的褶皺，給切片制作帶來方便。,冰凍切片,冰凍切片的種類較多，有低溫恒冷箱冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，甲醇循環(huán)制冷冰凍切片法等。,主要應用于：,用于有些水解酶如ATP酶，琥珀酸脫氫酶等的定位的組織化學

8、方法以及免疫組織化學方法等。用于證明脂肪及類脂和神經(jīng)組織髓鞘的染色時的切片，這常見于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研組織等。 用于臨床手術(shù)的快速病理診斷。神經(jīng)病理學技術(shù)中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。 對某些物質(zhì)所進行的免疫熒光的研究。,德國萊卡恒溫箱冷凍切片機,冷凍切片機工作原理,這并非特殊類型的切片機，只不過組織塊承托臺改換成急速冷凍（約零下20～3

9、0℃）裝置。這種急速冷凍裝置可以有兩種形式：一為通過液體CO2，在液體CO2蒸發(fā)時，急速吸收大量熱而使組織塊很快冷凍。另一種為半導體致冷裝置，借半導體元件電偶作用急速使組織承托臺降溫，在１～2分鐘內(nèi)也能達到組織凍結(jié)的目的。須注意的是，制作冰凍切片時，不但要使組織塊冷凍，同時還應是切片刀冷凍（如利用噴散的多余液體CO2或半導體致冷裝置使刀降溫）。這兩種冷凍裝置以半導體冷凍裝置使用方便，但需電源和水源。,冷凍切片機,該機的箱面上有電

10、子控制板，裝有即時冷凍鍵和除霜鍵，啟動即時冷凍鍵，機器馬上進行工作狀態(tài)。啟動即時除霜鍵，可將工作間頂部后面的制冷柵上的霜除掉。有照明鍵一個，啟動該鍵可照明工作間，有利工作及觀察組織的冰凍狀況。 除此之外，箱面的左邊有四個按鍵，兩個為快速自動進退鍵，兩個為微小進退鍵，還有一個手動旋鈕，調(diào)節(jié)修組織塊時的進退。 冷凍箱內(nèi)左邊的冷凍臺，溫度可達-60℃左右，冷凍箱的中間為一臺切片機，工作間的溫度在0-30℃間可任意調(diào)節(jié)，并在箱面上的熒屏顯示

11、出來。,操作方法及步驟,①取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整，最好為24×24×2mm。②取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上，冰凍。小組織的應先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小臺后，再放上細小組織，滴上包埋劑。 ③將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機持承器上，啟動粗進退鍵，轉(zhuǎn)動旋鈕，將組織修平。④調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細胞密集

12、的薄切，纖維多細胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。,操作方法及步驟,⑤調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細心，準確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當?shù)奈恢?。切片時，切出的切片能在第一時間順利地通過刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。 ⑥應視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據(jù)不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經(jīng)固定的腦組織，

13、肝組織和淋巴結(jié)時，冷凍箱中的溫度不能調(diào)太低，在-10- -15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時，可調(diào)在-15～20℃左右，切帶脂肪的組織時，應調(diào)至-25℃左右，切含大量的脂肪時，應調(diào)至-30℃。冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分鐘后即可染色。 如果不做染色，可用固定液固定放于恒冷箱。,冰凍切片的優(yōu)點,1．簡便，可以不需要對組織固定、脫水、透明、包埋等手續(xù)即可進行切片，減少了一些中間環(huán)節(jié)。2．快速，用時短

14、。3．組織變化不大。4．能很好保存脂肪，類脂等成分。5．能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類，特別是對于那些對有機溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細胞膜表面抗原和水解酶保存較好。,冰凍切片的快速染色法,① 切片固定30秒－1分鐘。 ② 水洗。 ③ 染蘇木素3－5分鐘。 ④ 分化。 ⑤ 于堿水中返藍20秒。 ⑥ 伊紅染色10－20秒。 ⑦ 脫水，透明，中性樹膠封固。 冰凍組織1－2分鐘，切片1分鐘，固定1分鐘，染色共五分