激光微切割與定量PCR技術(shù)分析腎臟病理切片及腎小球RNA.pdf

1、目的：腎臟病理切片是腎臟疾病研究的重要方法之一。分析腎臟病理切片及其特異性組份如腎小球中的基因水平，可以為研究腎臟疾病發(fā)病機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然而，成功提取病理切片及腎小球中的RNA是研究切片中基因水平的基礎(chǔ)。本課題利用激光微切割技術(shù)和定量PCR技術(shù)，定位和定量的檢測(cè)了不同提取方法和不同固定劑對(duì)腎臟病理切片及腎小球中RNA的作用。 方法：選用6只3月齡體重為250 g Wistar大鼠，取其腎臟，用于制作冰凍切片和石蠟切片。

2、采用丙酮、甲醇-氯仿-冰醋酸(Methacam)、10％中性福爾馬林三種固定劑分別固定組織，以制作三種不同的石蠟切片；做好的三種不同石蠟切片，采用RNA裂解液、Trizol Agent 2種方法提取其中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄為eDNA，使用普通PCR擴(kuò)增100bp纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)基因，180bp磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)和565bp Beta-肌動(dòng)蛋白以分析RNA質(zhì)量。采用SYBR GREEN 1定量PCR方法擴(kuò)增8

3、7bp GAPDH分析RNA的含量。用70％乙醇、丙酮、甲醇、4％多聚甲醛固定冰凍切片，使用激光微切割技術(shù)切取腎小球，用異硫氰酸胍(GTC)方法和Trizol Agent方法提取RNA，采用Taqman探針定量PCR檢測(cè)GAPDH基因以分析RNA含量；選取丙酮固定的石蠟切片和冰凍切片，使用激光微切割技術(shù)切取腎小球，采用RNA裂解液提取石蠟切片中RNA，采用GTC提取冰凍切片的RNA，使用Taqman定量PCR方法檢測(cè)GAPDH，比較石蠟

4、切片和冰凍切片中RNA含量。 結(jié)果：對(duì)于石蠟切片，我們經(jīng)兩種方法提取的RNA均可經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出180bp大鼠磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH)、565bp β-肌動(dòng)蛋白(β-ACTIN)及100bp PAl-1基因：定量PCR檢測(cè)GAPDH結(jié)果顯示：采用RNA裂解液時(shí)，三種固定方法固定的切片之間RNA含量相似，且提取的RNA含量均高于Trizol方法：采用Trizol方法提取時(shí)，沉淀性固定劑丙酮的RNA產(chǎn)量最高， methac

5、arn方法次之，中性福爾馬林方法提取的效果最差。對(duì)于冰凍切片中的腎小球，用沉淀性固定劑如乙醇、丙酮、甲醇方法固定切片、提取RNA時(shí)，兩種提取方法和三種固定方法對(duì)RNA含量的影響都無(wú)明顯差異；但在提取4％多聚甲醛固定的切片中腎小球RNA時(shí)，使用Trizol提取RNA含量明顯高于使用GTC方法，且其含量與沉淀性固定劑固定的切片RNA含量無(wú)明顯差異，而用GTC方法提取量較少。通過(guò)激光微切割技術(shù)，切取石蠟切片與冰凍切片中腎小球，兩者中RNA含量