朊病毒及其檢測(cè)

1、朊病毒及其檢測(cè),小組成員：石勇軍 費(fèi) 鵬 閆 凱 王培培 嚴(yán) 姍 辛儒岱關(guān)亞飛 崔金紅,CONTENTS,,五、朊病毒的檢測(cè),,1,,引言,傳染性海綿狀腦病(transmissible spongi-form encephalopathy, TSE)是一類(lèi)致死性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。在哺乳動(dòng)物中常見(jiàn)瘋牛病、羊瘙癢癥、貓海綿狀腦病以及傳染性水貂腦軟化病等；在人身上則發(fā)現(xiàn)了庫(kù)魯病、致死性家族失眠

2、癥、克-雅氏病以及格斯特曼綜合癥等?；疾〉娜撕蛣?dòng)物，大腦皮層的神經(jīng)元細(xì)胞會(huì)發(fā)生進(jìn)行性空泡化, 星形膠質(zhì)細(xì)胞不斷增生, 造成灰質(zhì)變薄而白質(zhì)相對(duì)明顯,最后變成海綿狀態(tài)。,（左）病羊神經(jīng)組織的海綿狀損傷。（右）病人大腦組織切片，海綿狀病變及周?chē)某恋戆?,2,,朊病毒的發(fā)現(xiàn),,3,,朊病毒引起的人類(lèi)疾病,,4,,朊病毒引起的人類(lèi)疾病,,,5,,疾病來(lái)源,,,6,,致病特點(diǎn),PrPc PrPSc,α螺旋,β折疊

3、,,二者是異構(gòu)體,由同一染色體基因PRNP編碼，其氨基酸序列完全一致,根本差別在于它們構(gòu)象上的差異，PrPC分子中含42%的α螺旋，β折疊僅為3 %，而PrPSC的β折疊高達(dá)43 %，α螺旋為30 %。故一般認(rèn)為，PrPSC是由于PrPC發(fā)生蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，一些α螺旋變構(gòu)為β折疊，三維構(gòu)象發(fā)生變化而產(chǎn)生的，同時(shí)帶來(lái)一系列理化性質(zhì)的變化。,,4,,PrPC向PrPSC的轉(zhuǎn)化,（PrPSc的累積）,（PrP轉(zhuǎn)化為PrPSc),(PrP與Pr

4、PSc之間反應(yīng)),（PrPc內(nèi)生）,模型一 ：該模型是假定一個(gè)單一的PrPSC分子與一個(gè)單一的PrPC分子結(jié)合并催化其轉(zhuǎn)化成PrPSC。這兩個(gè)PrPSC分子,可以繼續(xù)轉(zhuǎn)換成PrPC。,(伸長(zhǎng)),（構(gòu)象變化),(破碎成多個(gè)部分),（感染）,模型二：假設(shè)PrPSC只是纖維，捆綁PrPC fibril，然后將其轉(zhuǎn)化成PrPSC，形成更長(zhǎng)的纖維，這一現(xiàn)象可在染病毒致病中觀察到。,PrPC的功能,,1,,維持神經(jīng)系統(tǒng)功能,在所有細(xì)胞類(lèi)型中,以神經(jīng)

5、元表達(dá)PrPC水平最高，且PrPC高度富集于突觸處(終板處也有富集)，這提示PrPC對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有特殊的重要性。PrPC除實(shí)驗(yàn)表明，PrPC缺失雖不引起肉眼可見(jiàn)的行為和發(fā)育障礙，但在整體動(dòng)物水平來(lái)看可導(dǎo)致與晝夜節(jié)律有關(guān)的行為異常。在神經(jīng)系統(tǒng)水平，PrPC缺失可導(dǎo)致電生理參數(shù)方面的改變。,有證據(jù)表明，在出現(xiàn)進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)失調(diào)癥狀PrPC缺失小鼠中，發(fā)現(xiàn)腦部嚴(yán)重萎縮，蒲肯野細(xì)胞異常，因PrPC缺失可能引起蒲肯野細(xì)胞過(guò)度興奮而導(dǎo)致小鼠死亡。PrP

6、C缺陷鼠還表現(xiàn)出對(duì)外源性銅和過(guò)氧化氫等應(yīng)激誘導(dǎo)劑應(yīng)答方面的改變。在細(xì)胞水平，PrPC缺陷鼠的神經(jīng)元在培養(yǎng)時(shí)存活能力下降，且對(duì)銅和阿拉伯糖胞苷(AraC)等所導(dǎo)致的氧化損傷和毒性的敏感性增加；星形膠質(zhì)細(xì)胞在攝取谷氨酸方面有異常；小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)興奮物質(zhì)的反應(yīng)性下降；在突觸形成中有結(jié)構(gòu)改變。由此可見(jiàn)，PrPC可能在一定程度上參與神經(jīng)系統(tǒng)功能的維持。,,2,,參與神經(jīng)組織的Cu2+代謝,PrPC作為腦組織中膜在銅結(jié)合蛋自參與神經(jīng)組織中Cu

7、2+的穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)節(jié)，當(dāng)轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSC就失去結(jié)合Cu2+的能力，造成神經(jīng)組織中Cu2+含量異常，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷。 Cu2+對(duì)不同神經(jīng)細(xì)胞PrPC的影響也不相同。,,3,,抗氧化,PrPC通過(guò)與銅原子形成復(fù)合物而發(fā)揮抗氧化活性。PrPC借其八肽重復(fù)區(qū)最多可結(jié)合4個(gè)銅原子。結(jié)合后形成的復(fù)合物具有抗氧化活性，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。,,4,,參與淋巴細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),PrPC可高水平地在人T、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞中表

8、達(dá)，不同細(xì)胞中表達(dá)PrPC的糖基組成、糖鏈形狀及蛋自酶解的敏感性都有差異。 T細(xì)胞的活化伴隨著其表而PrPC的表達(dá)上調(diào)，且PrPC在記憶T細(xì)胞比初始T細(xì)胞的表達(dá)水平高。,,5,,細(xì)胞凋亡,在PrP敲除小鼠神經(jīng)元中，多種凋亡相關(guān)蛋自顯著增加，線(xiàn)粒體Ca2+含量改變、細(xì)胞色素c釋放，都表明PrP參與細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程。 體外試驗(yàn)也顯示PrPC能夠保護(hù)人的神經(jīng)元免受Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而缺失八肽序列或C端帶有突

9、變的PrP均不具有該活性。,,6,,核酸代謝,Gabus等根據(jù)小鼠中瘟癢病的感染過(guò)程會(huì)因鼠自血病病毒（MuLV）的復(fù)制而加速，以及人類(lèi)PrP功能上類(lèi)似于NCp7，可輔助反轉(zhuǎn)錄酶合成前病毒DNA等現(xiàn)象，提出PrP可能參與了體內(nèi)核酸代謝過(guò)程。,,,,致病機(jī)理,,1,,阮病毒學(xué)說(shuō),PrPC是一種膜蛋白，其C端含有23個(gè)氨基酸組糖基磷酸肌醇(GPI)錨受體結(jié)合位點(diǎn)，因此可通過(guò)糖基肌醇磷酸脂(glycoirmitol phosphohptds)聯(lián)

10、在膜上，定位于細(xì)胞膜的穴樣內(nèi)陷類(lèi)結(jié)構(gòu)域（CLDs），在神經(jīng)元，當(dāng)膜漿膜上的PrPC變成為PrPSC后，PrPSC脫落并聚集在神經(jīng)元的溶酶體。當(dāng)達(dá)到數(shù)量，就可使神經(jīng)元細(xì)胞破裂，形成神經(jīng)組織的空泡化，并使星型膠質(zhì)細(xì)胞增生，,,2,,“yeast prions”學(xué)說(shuō),,,3,,蛋白的氧化反應(yīng)學(xué)說(shuō),楊池明提出了瘋牛病蛋白長(zhǎng)壽命自由基即為瘋牛病中的亞病毒的理論設(shè)想，他認(rèn)為真正的瘋牛病蛋白亞病毒可能是由蛋白的氧化反應(yīng)所形成的瘋牛病蛋白自由基。

11、 應(yīng)用此理論能夠解釋瘋牛病的一些病理現(xiàn)象。,,朊病毒的檢測(cè),取組織標(biāo)本,10個(gè)稀釋濃度,直到死亡或盲傳幾代,飼養(yǎng)24h,補(bǔ)接,,1,,動(dòng)物的接種傳遞實(shí)驗(yàn),取標(biāo)本,1. 前處理,2. 檢測(cè),NC：硝酸纖維素膜,前處理品,免疫學(xué)檢測(cè),取出NC膜,5-7μm薄片,收集在NC上,2mm厚切片,切片,55℃水浴,,2,,組織印記法,勻漿,離心,處理,顯色,最后酶標(biāo)儀讀板,將腦組織置于8%的Zwittergent 3-12和0.5%十二烷

12、基肌氨酸鈉中,加入特異性一抗加入酶標(biāo)二抗最后加入底物,用膠原酶、DNase I（脫氧核糖核酸酶I），蛋白酶K處理,收集富含PrPsc沉淀，將所得沉淀溶于3-4mol/L硫氰酸胍，包被酶標(biāo)版,,3,,酶聯(lián)免疫吸附法,人工合成的PrPsc特異性肽鏈標(biāo)記熒光,一定量的特異性抗體、羊腦提取物,標(biāo)記的肽鏈與抗體結(jié)合后，遷移率發(fā)生改變,未與抗體結(jié)合的肽鏈，遷移率不變,當(dāng)腦提取物中存在微量的PrPsc時(shí),當(dāng)腦提取物中不存在微量的PrPsc時(shí),電泳

13、,,,,4,,毛細(xì)管凝膠電泳免疫測(cè)定法,,,,如何對(duì)非結(jié)晶型的朊病毒蛋白進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確分析，能否尋找一種方法，可以獲得朊病毒蛋白的準(zhǔn)確的高級(jí)結(jié)構(gòu)。,朊病毒的致病原因是PrPsc的過(guò)度增殖還是由于PrPc正常功能的缺失。,體外試驗(yàn)產(chǎn)生PrPSC到底有無(wú)感染性，PrPSC的增殖是否需要其他輔助因子（如RNA）的參與。,科學(xué)家已經(jīng)做了大量的關(guān)于朊病毒的研究工作，在許多方面取得了重要的進(jìn)展，諸如PrPC與PrPSC的