分子生物學(xué)基本技術(shù)

1、分子生物學(xué)基本技術(shù),講授內(nèi)容,一、分子雜交與印記技術(shù)二、PCR技術(shù)三、基因文庫(kù)四、DNA測(cè)序技術(shù)五、芯片技術(shù)六、蛋白質(zhì)相互作用研究,一、分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization & Blotting Technology,核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA復(fù)性過(guò)程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DN

2、A或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex) 。,一、基本原理,（一）印跡技術(shù)（二）探針技術(shù),探針 (probe) 一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。,二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用,（一）DNA印跡技術(shù) (Southern blotting) 用于基因組DNA、重組質(zhì)粒

3、和噬菌體的分析。,（二）RNA印跡技術(shù) (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。,（三）蛋白質(zhì)的印跡分析 (Western blotting) 用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。,三種印跡技術(shù)的比較,放射自顯影照片,其他雜交技術(shù)：斑點(diǎn)印跡 (dot blotting) 原位雜交 (in situ hybridization)DNA點(diǎn)陣 (DNA array) DNA芯片技術(shù)

4、 (DNA chip),斑點(diǎn)雜交（dot blotting）,將RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達(dá)產(chǎn)物的定性及定量的研究。,反向斑點(diǎn)雜交（reverse dot blotting）,先將探針固定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，將樣品RNA或DNA標(biāo)記變性后進(jìn)行雜交。改變了傳統(tǒng)雜交方法中一次雜交只能檢測(cè)一種樣品的局限，大大提高了基因診斷的效率。,13,原位分子雜交技術(shù),原位雜交（in situ

5、hybridization，ISH）即利用分子雜交技術(shù)來(lái)進(jìn)行基因及其表達(dá)產(chǎn)物定位分析的一種技術(shù)；可用于基因及其表達(dá)產(chǎn)物的定位分析。,熒光原位雜交（FISH）,DNA點(diǎn)陣,二、聚 合 酶 鏈 反 應(yīng) Polymerase Chain Reaction,,5?,Primer 1,,5?,Primer 2,,,,5?,5?,Template DNA,,,,,,一、基本原理,,,,,,,,,模板DNA 特異性引物耐熱DNA聚

6、合酶 dNTPs Mg2+,二、PCR體系基本組成成分,三、PCR的基本反應(yīng)步驟,變性95?C,延伸72?C,退火Tm-5?C,,,,,（一）目的基因的克隆（二）基因的體外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測(cè)定（五）基因突變分析,四、PCR的主要用途,三、幾種重要的PCR衍生技術(shù),（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（二）原位PCR技術(shù)（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù),實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理,三、基 因 文 庫(kù)

7、 Gene Library,基因組DNA文庫(kù) (genomic DNA library)cDNA文庫(kù) (cDNA library),基因文庫(kù) (gene library),是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。,基因組DNA文庫(kù),第一輪篩選,第二輪篩選,第三輪篩選,基因組文庫(kù)篩選結(jié)果舉例,四、DNA序列測(cè)定分析 Nucleic Acid Sequence Analysis,一、DNA鏈末端合成終止法,二

8、、DNA自動(dòng)測(cè)序,采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過(guò)四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)熒光，檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并依此確定DNA堿基的排列順序。,DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例,五、芯片分析技術(shù),Biological Chip Technology,DNA芯片(DNA chi