AGEs通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬影響糖尿病創(chuàng)面愈合的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　皮膚的創(chuàng)傷愈合是對(duì)損傷組織復(fù)雜、動(dòng)態(tài)的修復(fù)過程，一般包括炎癥反應(yīng)期，細(xì)胞增殖期和重塑期三個(gè)相互重疊的時(shí)期。多種因素可以影響創(chuàng)面的修復(fù)，如血管神經(jīng)病變、機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、感染、藥物、免疫功能障礙等。糖尿病導(dǎo)致的難愈創(chuàng)面是臨床常見的慢性創(chuàng)面之一。糖尿病慢性創(chuàng)面的形成是一個(gè)多因素共同作用的結(jié)果，其致病機(jī)制仍不完全明確。糖尿病狀態(tài)下，體內(nèi)蓄積的糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AG

2、Es）可通過抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的功能從而影響創(chuàng)面愈合的各個(gè)階段，最終導(dǎo)致創(chuàng)面的難愈。盡管大量的研究聚焦于對(duì)糖尿病創(chuàng)面的治療，然而糖尿病難愈創(chuàng)面形成的潛在機(jī)制仍不明確。自噬是細(xì)胞通過溶酶體系統(tǒng)對(duì)胞內(nèi)積聚的蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器進(jìn)行降解，然后再利用的代謝途徑，是細(xì)胞維持自身穩(wěn)態(tài)和存活的機(jī)制之一。臨床研究已證實(shí)免疫抑制劑雷帕霉素治療移植后抗排斥反應(yīng)時(shí)，能夠?qū)е禄颊邉?chuàng)面的愈合延遲，同時(shí)雷帕霉素被認(rèn)為是經(jīng)典的自噬誘導(dǎo)劑，這表明自噬可能

3、與創(chuàng)面的愈合過程相關(guān)。本研究擬通過建立小鼠背部皮膚創(chuàng)面模型探討自噬在糖尿病慢性創(chuàng)面形成中的作用，并進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)闡明AGEs誘導(dǎo)的自噬導(dǎo)致創(chuàng)面愈合延遲的機(jī)制。
　　目的：
　　闡明自噬對(duì)糖尿病創(chuàng)面愈合的影響和作用，并探討其可能的分子機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分：構(gòu)建C57BL/6小鼠全層皮膚缺損模型，采用免疫組化和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)創(chuàng)面愈合過程各時(shí)相點(diǎn)（d0,d1,d3,d7,d14,d21）LC3和Bec

4、lin-1的表達(dá)，觀察自噬在創(chuàng)面愈合中的變化。同時(shí)，應(yīng)用電鏡觀察創(chuàng)面自噬體的數(shù)量和結(jié)構(gòu)；通過小鼠腹腔注射雷帕霉素和3-MA，觀察自噬增強(qiáng)或抑制后對(duì)創(chuàng)面愈合的影響；建立db/db糖尿病小鼠及db/m對(duì)照組小鼠全層皮膚創(chuàng)面模型，應(yīng)用3-MA干預(yù)db/db糖尿病小鼠，觀察各組小鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間，并通過免疫組化和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)LC3在各組小鼠創(chuàng)面中的表達(dá)差異。同時(shí)，收集臨床糖尿病和非糖尿病患者的正常組織（各5例）及慢性創(chuàng)面組織（糖尿病患者44例

5、，非糖尿病患者20例），通過免疫組化技術(shù)檢測(cè)創(chuàng)面LC3的表達(dá)。
　　第二部分：構(gòu)建C57BL/6小鼠全層皮膚缺損模型，經(jīng)皮膚創(chuàng)緣注射AGEs，觀察創(chuàng)面愈合時(shí)間，應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)創(chuàng)面愈合過程中（d0，d3，d7，d14）LC3的表達(dá)。另外，在AGEs創(chuàng)緣注射的同時(shí)腹腔注射3-MA，觀察創(chuàng)面的愈合情況，并應(yīng)用免疫熒光和激光共聚焦觀察LC3的細(xì)胞定位。分別用雷帕霉素和3-MA處理RAW264.7細(xì)胞，通過western blot技術(shù)

6、觀察巨噬細(xì)胞LC3的改變，流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞膜標(biāo)記物CD11c（M1）和CD206（M2）的表達(dá)，并利用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞M1或M2相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。應(yīng)用AGEs或者AGEs和3-MA同時(shí)干預(yù)RAW264.7細(xì)胞，通過電鏡觀察細(xì)胞自噬體變化，應(yīng)用western blot技術(shù)觀察巨噬細(xì)胞LC3的改變，利用流式細(xì)胞學(xué)和real-time PCR技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞的極化。
　　第三部分：構(gòu)建shIRF8干

7、擾的RAW264.7細(xì)胞株，AGEs干預(yù)RAW264.7以及shIRF8細(xì)胞株，通過應(yīng)用western blot、免疫熒光和激光共聚焦觀察巨噬細(xì)胞LC3的改變，并通過real-time PCR技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化的改變。
　　結(jié)果：
　　第一部分：LC3和Beclin1在小鼠皮膚創(chuàng)面中均有表達(dá)，且創(chuàng)傷后表達(dá)均逐漸增多，d7、d14表達(dá)最高，以后逐漸減少，d21基本恢復(fù)正常；雷帕霉素能夠明顯增加LC3的表達(dá)，而3-MA抑制LC

8、3的表達(dá)。電鏡觀察自噬小體的數(shù)量在d7明顯增加。雷帕霉素組小鼠創(chuàng)面愈合明顯延遲，同時(shí)應(yīng)用3-MA干預(yù)小鼠后，創(chuàng)面愈合加快；db/db小鼠較對(duì)照組db/m小鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯延遲（25.8?0.59 vs15.9?0.82 d），經(jīng)腹腔注射3-MA后創(chuàng)面愈合速度加快，但仍遲于db/m組小鼠。db/db組小鼠創(chuàng)面LC3表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組小鼠；糖尿病患者慢性創(chuàng)面組織中LC3的表達(dá)明顯高于非糖尿病創(chuàng)面組織。
　　第二部分：AGEs

9、組小鼠較對(duì)照組創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯延遲（18.0?0.67 vs14.8?0.79 d），3-MA與AGEs同時(shí)干預(yù)組小鼠愈合時(shí)間較AGEs組加快（15.0?0.82 d），但仍遲于對(duì)照組小鼠。AGEs組小鼠創(chuàng)面LC3表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組小鼠，d7、d14明顯增高。通過免疫熒光和激光共聚焦技術(shù)證實(shí)大部分LC3的表達(dá)與F4/80發(fā)生共定位染色。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)AGEs能夠增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞LC3的表達(dá)，同時(shí)電鏡結(jié)果顯示自噬體增多。

10、雷帕霉素能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞 LC3的表達(dá)，并增加M1巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD11c的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（27.86±1.37%vs13.61±10.97%），而3-MA能夠抑制LC3的表達(dá)，并且分別減少CD11c陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。并且；雷帕霉素和3-MA分別能夠增加和減少tnf-a、il-1b、il-6、inos的表達(dá)（M1相關(guān)細(xì)胞因子），而對(duì)M2相關(guān)的細(xì)胞因子的影響不明顯。AGEs可以增加CD11c陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞數(shù)量（28.11±0.87%），并促進(jìn)tnf

11、-a、il-1b、il-6、inos等細(xì)胞因子，而3-MA能夠抑制AGEs的作用。
　　第三部分：RAW264.7巨噬細(xì)胞經(jīng)shIRF8干擾后，AGEs對(duì)LC3的誘導(dǎo)受到抑制，并且shIRF8阻斷了AGEs對(duì)tnf-a、il-1b、il-6、inos等M1相關(guān)炎癥因子的的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論：
　　1.糖尿病小鼠和糖尿病患者皮膚創(chuàng)面自噬增強(qiáng)與創(chuàng)面的愈合延遲相關(guān)；
　　2. AGEs通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬促進(jìn)M1的極