蛋白質(zhì)的分離與純化

1、蛋白質(zhì)的分離與純化蛋白質(zhì)分離純化的基本流程選擇材料和預(yù)處理細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分離蛋白質(zhì)的抽提蛋白質(zhì)的純化濃縮、干燥和保存一、材料的選擇和預(yù)處理微生物、植物和動(dòng)物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定。從工業(yè)生產(chǎn)角度考慮，注意選含量高、來(lái)源豐富及成本低的原料。對(duì)動(dòng)物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先除去結(jié)締組織和脂肪組織。對(duì)預(yù)處理好的材料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)冷凍保存，對(duì)于易分解的生物大分子應(yīng)選

2、用新鮮材料制備。二、細(xì)胞的破碎（一）機(jī)械方法：主要通過(guò)機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破壞。高速組織搗碎機(jī)（轉(zhuǎn)速可達(dá)10000rpm，具高速轉(zhuǎn)動(dòng)的鋒利的刀片），適用于動(dòng)物內(nèi)臟組織的破碎。玻璃勻漿器（用兩個(gè)磨砂面相互摩擦，將細(xì)胞磨碎），適用于少量材料；也可用不銹鋼或硬質(zhì)塑料等，兩面間隔只有十分之幾毫米，對(duì)細(xì)胞破碎程度比高速搗碎機(jī)高，機(jī)械切力對(duì)分子破壞較小。小量的也可用乳缽與適當(dāng)?shù)木彌_劑磨碎提取，也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細(xì)。（二）物理方法：主

3、要通過(guò)各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎。反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。超聲波法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料；只要有設(shè)備，該法方便且效果也好，但一次處理量較小。應(yīng)用超聲波處理時(shí)應(yīng)注意避免溶液中氣泡的存在。處理一些超聲波敏感的蛋白質(zhì)酶時(shí)宜慎重。（三）化學(xué)及生物化學(xué)法有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十

4、二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等使細(xì)胞膜破壞；細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，采用溶菌酶處理效果更好。此外一些細(xì)胞膜較脆弱的細(xì)胞，可把它們置于水或低滲緩沖劑中透析將細(xì)胞脹破。細(xì)胞器的分離制備某一種生物大分子需要采用細(xì)胞中某一部分的材料，或者為了純化某一特定細(xì)胞器上的生物大分子，防止其他細(xì)胞組分的干擾，細(xì)胞破碎后常將細(xì)胞內(nèi)各組分先行分離，以便于獲得更好的分離效果。細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法細(xì)胞經(jīng)過(guò)破碎后，在適當(dāng)介質(zhì)中進(jìn)行差速離心。利用細(xì)胞各組分質(zhì)

5、量大小不同，沉降于離心管內(nèi)不同區(qū)域，分離后即得所需組分。細(xì)胞器的分離制備，介質(zhì)的選擇現(xiàn)一般用蔗糖、Ficoll或葡萄糖聚乙二醇等溶液。三、蛋白質(zhì)的提取提取是將經(jīng)過(guò)預(yù)處理或破碎了的細(xì)胞或組織置于一定條件下的溶劑中，讓被提取的蛋白質(zhì)以溶解狀態(tài)充分地釋放出來(lái)，并盡可能保持原來(lái)的天然狀態(tài)，不丟失生物活性的過(guò)程。大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類(lèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化

6、蛋白質(zhì)。抽提所用緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)鹽析法向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽，在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱(chēng)鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱(chēng)鹽析。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。影響鹽析的因素溫度：一般室溫操作，對(duì)溫度敏感的蛋白可在低溫下

7、操作。pH：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶解度最低。蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(lái)（共沉現(xiàn)象）。鹽析中常用的中性鹽：硫酸銨鹽析后除鹽的方法：常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋內(nèi)用緩沖液進(jìn)行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時(shí)間較長(zhǎng)，所以最好在低溫中進(jìn)行；也可用葡萄糖凝膠G25或G50過(guò)柱的辦法除鹽，所用的時(shí)間就比較短。等電點(diǎn)沉淀法蛋白質(zhì)在表面靜電荷為零狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥

8、力最小，因而溶解度也最小，利用各種蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差別，可通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。低溫有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度降低；有機(jī)溶劑與水作用能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中沉淀析出。常用的有機(jī)溶劑是乙醇和丙酮，一般宜在低溫下進(jìn)行，且在加入有機(jī)溶劑時(shí)注意攪拌均勻以免局部濃度過(guò)大。（二）蛋白質(zhì)粗品的純化

9、常用的純化方法有：凝膠過(guò)濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等。通常幾種方法聯(lián)合使用來(lái)獲得較高純度的蛋白質(zhì)樣品。凝膠過(guò)濾（分子篩）是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠作分離介質(zhì)，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同對(duì)混合物進(jìn)行分離的技術(shù)。層析柱中的填料是某些惰性的具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類(lèi)物質(zhì)，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，流下來(lái)速度慢，而大分子物質(zhì)卻被排除在外部，流下來(lái)的速度快，當(dāng)混合物通過(guò)凝膠過(guò)濾層析柱時(shí)，溶液中的物質(zhì)就按不