苦蕎麥蛋白質(zhì)的分離純化及功能特性研究.pdf

1、蕎麥屬于蓼科(Polygonaceae)，蕎麥屬(Fagoprum)，是雙子葉植物?？嗍w麥?zhǔn)俏覈赜械男‰s糧品種。本論文對苦蕎麥蛋白質(zhì)的消化特性、抗腫瘤活性及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入的研究，主要研究內(nèi)容如下： 首先采用傳統(tǒng)Osborne分級分離蛋白的方法對苦蕎麥蛋白質(zhì)四種組分進(jìn)行分級制備，并對其理化性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，四種組分中清蛋白的含量最高(43.82％)，其次為谷蛋白(14.58％)，醇溶蛋白(10.50％)，球蛋白的含量最低(

2、7.82％)。四種蛋白質(zhì)組分的必需氨基酸含量豐富，并且組成較為均衡。還原和非還原SDS-PAGE分析表明，苦蕎麥蛋白質(zhì)四種組分中均存在二硫鍵。在非還原條件下，清蛋白主要亞基的相對分子質(zhì)量分別為64000、57000、41000和38000；球蛋白主要亞基的相對分子質(zhì)量分別為57000、28000、23000、19000和15000。還原條件下，清蛋白和球蛋白都有相對分子質(zhì)量為41000和38000的亞基，醇溶蛋白主要亞基的相對分子質(zhì)量分

3、別為29000、26000、17000和15000。 與對照蛋白-小麥胚分離蛋白和大豆分離蛋白相比，苦蕎麥蛋白質(zhì)的體外消化率偏低，是一種低消化性蛋白?？嗍w麥蛋白質(zhì)四種組分的體外消化率存在一定的差別，四種組分中清蛋白的消化率最高，但是仍低于對照蛋白?？嗍w麥蛋白質(zhì)的消化率較低主要是蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)造成的，此外分子內(nèi)和分子間二硫鍵的存在對蛋白質(zhì)的消化性也有一定的影響，蘆丁的添加沒有降低四種組分的體外消化率。 通過掃描電鏡圖對苦

4、蕎麥四種蛋白質(zhì)組分酶解產(chǎn)物的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，胃蛋白酶作用于四種組分的方式是不同的，胃蛋白酶不僅可以作用于清蟹白和球蛋白的表面，而且隨著水解進(jìn)程的延長胃蛋白酶還可以作用于清蛋白和球蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，因此其體外消化率相對較高。而對于醇溶蛋白和谷蛋白，其高級結(jié)構(gòu)相對較為穩(wěn)定，胃蛋白酶只能作用于其表面，很難作用其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，所以這兩種蛋白組分的體外消化率相對較低。 通過高效液相色譜對苦蕎麥四種蛋白質(zhì)組分酶解產(chǎn)物的分子量分布進(jìn)行研究，結(jié)

5、果表明，清蛋白和球蛋白的酶解產(chǎn)物分子量相對較低，組分多，酶解程度高。醇溶蛋白酶解物的組成較為簡單，這可能是由于被胃蛋白酶作用的位點較少所造成的。而谷蛋白酶解產(chǎn)物的分子量分布廣，高分子量的組分所占比例大，這表明谷蛋白被酶解的程度相對較低。 苦蕎麥蛋白質(zhì)四種組分分別經(jīng)胃蛋白酶水解3h后，殘渣蛋白的還原十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)存在相似之處。蛋白質(zhì)經(jīng)過水解后，仍有部分殘渣蛋白未被水解，其殘渣蛋白的電泳譜帶比

6、較擴(kuò)散，四種組分在相對分子質(zhì)量20000處有一條很窄的譜帶，在14000-10000處的譜帶較寬。此外，球蛋白在相對分子質(zhì)量9000有一條明顯的譜帶。 采用硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose FF離子交換色譜、Sephadex G-100凝膠過濾色譜和Sephacryl S-200凝膠過濾色譜對苦蕎麥水溶性蛋白質(zhì)(TBWSP)逐步分離純化，并結(jié)合細(xì)胞實驗，篩選出苦蕎麥水溶性蛋白質(zhì)中體外抗腫瘤活性的有效組分，命名為TBW

7、SP31。體積排阻一高效液相色譜(SE-HPLC)和SDS-PAGE分析表明，TBWSP31為單體蛋白，其相對分子質(zhì)量為57000。 體外抗腫瘤活性實驗(MTT法)表明，TBWSP31對人乳腺癌細(xì)胞株Bcap37的生長有明顯的抑制作用，并且存在時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)。48h和72h的IC<,50>值分別為43.37μg/mL、19.75μg/mL。 通過光鏡、掃描電鏡和流式細(xì)胞儀對TBWSP31的抗腫瘤機(jī)理進(jìn)行了研究。HE染

8、色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞經(jīng)樣品作用后，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的明顯特征，細(xì)胞變形，變小，細(xì)胞核固縮、裂解，染色質(zhì)染成深藍(lán)色或藍(lán)黑色，細(xì)胞膜皺褶、卷曲和出泡，并且有細(xì)胞膜包裹的凋亡小體生成。掃描電鏡下觀察細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞表面微絨毛大量減少，有的甚至消失，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞膜皺縮，表面凸起，似出芽現(xiàn)象，形成了大量的小泡，有的小泡已經(jīng)脫落，成為凋亡小體。 采用流式細(xì)胞儀PI單染色法檢測TBWSP3l對Bcap37細(xì)胞周

9、期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TBWSP31對Bcap37細(xì)胞的增殖抑制作用存在時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)。TBWSP31作用于Bcap37細(xì)胞后，G<,0>/G<,1>期細(xì)胞比例增加，DNA合成期-S期細(xì)胞減少，說明細(xì)胞受阻于G<,0>/G<,1>期，可阻滯G<,0>/G<,1>期的細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化。細(xì)胞周期的長短主要決定于G<,1>期，G<,1>期阻滯使Bcap37細(xì)胞周期延長，細(xì)胞的惡性增殖相應(yīng)減慢。采用流式細(xì)胞儀FITC-IgG標(biāo)記法檢測TBWSP3

10、1對Bcap37細(xì)胞作用后癌基因和抑癌基因的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TBWSP31可以上調(diào)抑癌基因蛋白Bax和Fas的表達(dá)，下調(diào)癌基因蛋白bcl-2和突變型p53的表達(dá)。 采用CD、FTIR和Raman光譜對TBWSP31的主鏈構(gòu)象和側(cè)鏈環(huán)境進(jìn)行分析，結(jié)果表明TBWSP31含有β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋和無規(guī)卷曲，其中β-折疊的含量較多，C-C-S-S-C-C側(cè)鏈為反式-扭式-反式構(gòu)象，酪氨酸殘基有的埋藏在疏水環(huán)境中，有的暴露于溶劑中，