細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)操作步驟(transwell)

1、遷移實(shí)驗(yàn)（遷移實(shí)驗(yàn)（cellmigrationassay）實(shí)驗(yàn)介紹實(shí)驗(yàn)介紹細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過(guò)不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：1材料準(zhǔn)備：材料準(zhǔn)備：可拍照顯微鏡，

2、Transwell小室，孔徑8μm，沒(méi)包被膠的(Coster和Cning公司的也較常用)，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板24孔板。細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購(gòu)買的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，無(wú)血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培養(yǎng)基，DMEM完全培養(yǎng)基，1640完全培養(yǎng)基（也可加到20%血清），無(wú)菌PBS，棉簽，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，結(jié)晶紫染液（0.1%（gml）PBS結(jié)晶紫）2步驟

3、和流程步驟和流程2.1基質(zhì)膠鋪板：基質(zhì)膠鋪板：用BD公司的Matrigel1：8（根據(jù)細(xì)胞產(chǎn)生mmp的量來(lái)決定）稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進(jìn)行基底膜水化。2.2制備細(xì)胞懸液制備細(xì)胞懸液①制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12－24h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。②消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基

4、重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至5105ml。2.3接種細(xì)胞接種細(xì)胞①取細(xì)胞懸液100l加入Transwell小室。②24孔板下室一般加入600l含20%FBS的培養(yǎng)基，特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。③培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)12－48h（主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。24h較常見(jiàn)，時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考慮到

5、細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對(duì)細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。2.4結(jié)果統(tǒng)計(jì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)直接計(jì)數(shù)法，“貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)，這里所謂的“貼壁”是指細(xì)胞穿過(guò)膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會(huì)掉到下室里面去，通過(guò)給細(xì)胞染色，可在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無(wú)鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30分鐘，將小室適當(dāng)風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫染色20min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS洗3遍。400倍顯微鏡下隨即五個(gè)視野觀察細(xì)胞，記數(shù)。實(shí)

6、驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料（7）Chamber和膜上都無(wú)法標(biāo)記，操作時(shí)應(yīng)小心避免混淆實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組；（8）充分晾干，避免殘留水分導(dǎo)致鏡下聚焦不一致。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（cellcellinvasioninvasionassayassay）實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料（1）Matrigel(BD5mgml)，20℃保存（2）其余材料同遷移實(shí)驗(yàn)操作步驟操作步驟（1）Matrigel在4℃過(guò)夜融化；（2）用4℃預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度1m

7、gml，冰上操作；（3）在chamber上室底部中央垂直加入100μl稀釋后的Matrigel，37℃溫育4－5小時(shí)使其干成膠狀；（4）后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)（18）。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)（1）Matrigel在過(guò)高或過(guò)低的溫度均易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應(yīng)提前在4℃預(yù)冷；（2）鋪膠時(shí)保證液面水平，膠的厚度均勻一致，切勿產(chǎn)生氣泡；（3）其他注意事項(xiàng)同遷移試驗(yàn)。其他其他Transwell做腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)的具體步驟做腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)的具體步驟(1)

8、基質(zhì)膠準(zhǔn)備：將凍存于－80度冰箱的BDmatrigel4度過(guò)夜（24h），變成液態(tài)；（2）取300ul無(wú)血清培養(yǎng)基，加入60ul（或50ug每室）Matrigel，混勻，（4℃操作，最好在冰浴上），加入上室各100ul（3個(gè)室）；放入37℃培養(yǎng)箱中，孵育45h（5h）；此間經(jīng)常觀察，當(dāng)出現(xiàn)“白色層”時(shí)，說(shuō)明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)。注釋：無(wú)血清培養(yǎng)基和基質(zhì)膠按1：5稀釋，每孔加50ul，在37℃培養(yǎng)箱中12h。（3）消化細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基洗3次，計(jì)