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文檔簡介
1、第五節(jié) 培養(yǎng)基(medium),定義:應科研或生產(chǎn)的需要,由人工配制的、適合于不同微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物用的營養(yǎng)基質(混合養(yǎng)料)。特點:任何培養(yǎng)基都應具備微生物所需要的六大營養(yǎng)要素,且應比例適當。所以一旦配成必須立即滅菌。用途:促進微生物生長;積累代謝產(chǎn)物;分離微生物菌種;鑒定微生物種類;微生物細胞計數(shù);菌種保藏;制備微生物制品。,培養(yǎng)基組分應適合微生物的營養(yǎng)特點(目的明確) 營養(yǎng)物的濃度與比例應恰當(營養(yǎng)協(xié)調) 物理化學
2、條件適宜(條件適宜) 根據(jù)培養(yǎng)目的選擇原料及其來源(經(jīng)濟節(jié)約),一、培養(yǎng)基的配制原則,(一)培養(yǎng)基組分應適合微生物的營養(yǎng)特點,即根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基;不同營養(yǎng)類型的微生物,其對營養(yǎng)物的需求差異很大。如自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基完全可以(或應該)由簡單的無機物質組成。異養(yǎng)微,,生物的培養(yǎng)基至少需要含有一種有機物質,但有機物的種類需適應所培養(yǎng)菌的特點。 按微生物的主要類群來說,它們所需要的培養(yǎng)基成分也不同:
3、 細菌: 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;LB (Luria-Bertani) 放線菌: 高氏一號培養(yǎng)基 真菌: 查氏合成培養(yǎng)基;PDA (Potato-Dextrose-Agar) 酵母菌; 麥芽汁 當對試驗菌營養(yǎng)需求特點不清楚的時候,可以采用“生長譜”法進行測定。,●濃度過高——微生物的生長起抑制作用, 濃度過小——不能滿足微生物生長的
4、需要?!裉嫉龋–/N)直接影響微生物生長與繁殖及代謝物的形成與積累,常作為考察培養(yǎng)基組成時的一個重要指標;,●速效性氮(或碳)源與遲效性氮(或碳)源的比例 ●各種金屬離子間的比例,碳源中的碳原子的mol數(shù)氮源中所含的氮原子的mol數(shù),C/N比值=,,例:谷氨酸生產(chǎn)中C/N =4/1時,菌體大量繁殖,谷氨酸積累少;C/N=3/1 時,菌體生長受抑制,而谷氨酸大量增加。,(二)營養(yǎng)物的濃度與比例應恰當,(1)pH:各類微生物的最
5、適生長pH值各不相同: 細 菌:7.0~8.0放線菌:7.5~8.5 酵母菌:3.8~6.0霉 菌:4.0~5.8 在微生物的生長和代謝過程中,由于營養(yǎng)物質的利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累,培養(yǎng)基的初始pH值會發(fā)生改變,為了維持培養(yǎng)基pH值的相對恒定,通常采用下列兩種方式:內(nèi)源調節(jié):在培養(yǎng)基里加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽;調節(jié)培養(yǎng)基的碳氮比。外源調節(jié):按實際需要不斷向發(fā)酵液流加酸或堿液
6、,(三)物理化學條件適宜,滲透壓等滲溶液適宜微生物生長高滲溶液細胞發(fā)生質壁分離低滲溶液細胞吸水膨脹,直至破裂,大多數(shù)微生物適合在等滲的環(huán)境下生長,而有的菌如Staphylococcus aureus則能在3mol/L NaCl的高滲溶液中生長。能在高鹽環(huán)境(2.8~6.2/L NaCl)生長的微生物常被稱為嗜鹽微生物(Halophiles)。,(2)滲透壓和aw,各種微生物對培養(yǎng)基的氧化還原電勢的要求:好氧微生物:+
7、0.3~+0.4V,(在>0.1V以上的環(huán)境中均能生長)。厭氧微生物:只能在+0.1V以下生長。兼性厭氧微生物:+0.1V以上呼吸、+0.1V以下發(fā)酵。培養(yǎng)基是多氧化還原偶的復雜電化學系統(tǒng),測出的Eh值僅代表其綜合結果。對微生物影響最大的是:分子氧和分子氫的濃度。培養(yǎng)基中常用的還原劑:巰基乙酸、抗壞血酸、硫化氫、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇等。,(3)氧化還原電勢(redox poyential),該培養(yǎng)基的應用目的
8、,即: 是培養(yǎng)菌體還是積累代謝產(chǎn)物? 是實驗室種子培養(yǎng)還是大規(guī)模發(fā)酵? 代謝產(chǎn)物是初級代謝產(chǎn)物還是次級代謝產(chǎn)物?,☆ 用于培養(yǎng)菌體種子的培養(yǎng)基營養(yǎng)應豐富,氮源含量宜高(碳氮比低);☆ 用于大量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基其氮源一般應比種子培養(yǎng)基稍低,(但若發(fā)酵產(chǎn)物是含氮化合物時,有時還應提高培養(yǎng)基的氮源含量);若代謝產(chǎn)物是次級代謝產(chǎn)物時要考慮是否加入特殊元素或特定的代謝產(chǎn)物;,(四)根據(jù)培養(yǎng)基的應用目的選擇
9、原料及其來源,1. 生態(tài)模擬:調查所培養(yǎng)菌的生態(tài)條件,查看“嗜好”,對“癥”下料——初級天然培養(yǎng)基。2. 查閱文獻:查閱、分析文獻,調查前人的工作資料,借鑒人家的經(jīng)驗,以便從中得到啟發(fā)設計有自己特色的培養(yǎng)基配方。3. 精心設計:借助優(yōu)選法或正交試驗設計法等方法。,二、設計培養(yǎng)基的方法,☆ 當所設計的是大規(guī)模發(fā)酵用的培養(yǎng)基時,應重視培養(yǎng)基中各成份的來源和價格,應選擇來源廣泛、價格低廉 的原料,提倡以粗代精,以廢代好。,4、實驗比 較:
10、 不同培養(yǎng)基配方的選擇比較 單種成分來源和數(shù)量的比較 幾種成分濃度比例調配的比較 小型試驗放大到大型生產(chǎn)條件的比較 pH和溫度試驗,◆ 附1:配置培養(yǎng)基時應注意的幾個問題及解決方法:,沉
11、淀 膠體強度的破壞 褐色物質的形成 pH發(fā)生變化,高壓蒸氣滅菌:一般培養(yǎng)基: 1.05 Kg/cm2, 121.3℃, 15~30 min。含糖培養(yǎng)基:0.56 Kg/cm2, 112.6 ℃, 15~30 min。干熱空氣滅菌: 160℃, 2 h。 過濾滅菌,分別滅菌, 間歇滅,附2:滅菌,附圖:過濾滅菌,菌,紫外光,化學藥物熏蒸(苯酚;高錳酸鉀+甲醛)的應用。,,三、培養(yǎng)基的類型其應用,1. 按對
12、培養(yǎng)基成分的了解程度來分,①天然培養(yǎng)基(complex medium):也稱作chemically undefined medium。利用化學成分還不完全清楚或不恒定的天然物質(如肉湯、蛋白胨、麥芽汁、酵母汁、豆芽汁、玉米粉、牛奶、血清等)制成的培養(yǎng)基,天然培養(yǎng)基比較經(jīng)濟,除實驗室經(jīng)常使用外,更適宜于在生產(chǎn)上用來大規(guī)模地培養(yǎng)微生物和生產(chǎn)微生物產(chǎn)品。,②合成(組合)培養(yǎng)基(synthetic medium):也稱作chemically d
13、efined medium. 由化學成分完全了解的物質配制而成的培養(yǎng)基,該類培養(yǎng)基的組成成分精確、清楚,重復性強,但微生物生長較慢,且價格昂貴,故一般適于在實驗室范圍內(nèi)有關微生物營養(yǎng)需要、代謝、分類鑒定、生物測定以及菌種選育、遺傳分析等方面的研究工作。如高氏培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基等。 ③半組合培養(yǎng)基(semi-defined medium):在合成培養(yǎng)基的基礎上添加些天然成份,以更有效地滿足微生物對營養(yǎng)物的需要,如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。,
14、①液體培養(yǎng)基(liquid medium):液體培養(yǎng)基不含任何凝固劑,菌體與培養(yǎng)基充分接觸,操作方便,常用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)以及在實驗室進行微生物生理代謝等基本理論的研究工作??蓳?jù)培養(yǎng)后的濁度判斷微生物的生長程度。 ②固體培養(yǎng)基(solid medium):天然固體營養(yǎng)基質制成的培養(yǎng)基,或液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑(瓊脂1.5~2%)而呈固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。為微生物的生長提供營養(yǎng)表面。常用于微生物的分離、純化、計數(shù)等方面的研究??梢朗?/p>
15、用目的不同而制成斜面、平板等形式。,2. 按制備后培養(yǎng)基外觀的物理狀態(tài)來分,③半固體培養(yǎng)基(semi-solid medium):在液體培養(yǎng)基中加入0.2~0.7%的瓊脂構成的培養(yǎng)基。常用來觀察細菌運動的特征,以進行菌種鑒定和噬菌體效價滴定等方面的實驗工作。 ④脫水培養(yǎng)基(dehydrated culture media):脫水商品培養(yǎng)基,預制干燥培養(yǎng)基,指含有除水以外的一切成分的商品培養(yǎng)基,使用時只要加入適量水分并加以滅菌即可,是一
16、類既有成分精確又有使用方便等優(yōu)點的現(xiàn)代化培養(yǎng)基。,1. 不被微生物分解、利用、液化;2. 不因消毒滅菌而被破壞;3. 在微生物的生長溫度內(nèi)保持固態(tài);4. 凝固點的溫度對微生物無害;5. 透明度好,粘著力強。,理想凝固劑應具備的條件,瓊脂(agar): 石花菜中提取的高度分支的復雜多糖明膠(gelatin): 膠原蛋白制備產(chǎn)物硅膠(silica gel): 硅酸納與鹽酸聚合而成, 純無機物,凝固劑種類:,①基礎培養(yǎng)基(min
17、imum medium): 是含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基; 另外基礎培養(yǎng)基也可作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎成分(如制備糖發(fā)酵培養(yǎng)基時)。 ②選擇性培養(yǎng)基(selective medium):是根據(jù)某種或某一類群微生物的特殊營養(yǎng)需要,或對某種化合物的敏感性不同而設計出來的一類培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來。,3. 按特殊用途劃分,③鑒別性培養(yǎng)基(differential
18、medium):用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基,在普通培養(yǎng)基中加入能與某種代謝產(chǎn)物發(fā)生反應的指示劑或化學藥品,從而產(chǎn)生某種明顯的特征性變化,以區(qū)別不同的微生物,例:伊紅美蘭乳糖培養(yǎng)基(Eosin Methylene Blue)。④加富培養(yǎng)基(enriched medium):在普通培養(yǎng)基中加入某些特殊的營養(yǎng)物,如血、血清、動、植物組織液或其他營養(yǎng)物質(或生長因子)的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。用來培養(yǎng)營養(yǎng)要求苛刻的微生物,或用以富集(數(shù)量上
19、占優(yōu)勢)和分離某中微生物。,G+菌受抑制,G-菌,能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸,不發(fā)酵乳糖不產(chǎn)酸,菌落無色透明,產(chǎn)酸力強,菌落呈紫綠色金屬光澤,,產(chǎn)酸力弱,菌落棕色,EnterbacterKlebsiellaHafniaSarrdia,ProteusSalmonellaShigella,E.coli,試樣,,,,,,,,,,EMB在鑒別各種腸道桿菌中的作用:,Left: Escherichia coli cells. Right: E.
20、coli colonies on EMB Agar.,EMB(Eosin Methylene Blue),細菌培養(yǎng)基——營養(yǎng)肉湯(nutrient broth): 牛肉膏 3g; 水 1000ml; 蛋白胨 5g ; pH 7.2~7.4放線菌培養(yǎng)基——高氏1號:
21、 可溶性淀粉 20g; KNO3 1g; K2HPO4 1g MgSO4 0.5g NaCl 1g; FeSO4?7H2O 0.5g 水 1000ml; pH 7.2~7.4霉菌培養(yǎng)基——查氏(zapek)培養(yǎng)基: 蔗糖
22、 30g; KCl 0.5g; MgSO4.H2O 0.5g; FeSO4 0.5g 水 1000ml; K2HPO4 1g; NaNO3 3g; pH 6.7酵母菌培養(yǎng)基——麥芽汁培養(yǎng)基,,
23、①細菌培養(yǎng)基 ②放線菌培養(yǎng)基 ③霉菌培養(yǎng)基,4. 根據(jù)所培養(yǎng)的微生物類群來分,①種子培養(yǎng)基(seed culture medium):是為保證發(fā)酵生產(chǎn)獲得大量優(yōu)質種子而設計的培養(yǎng)基,特點是營養(yǎng)較豐富,氮源比例較高。有時為使菌種能迅速適應后面的發(fā)酵條件,還有意識地加入發(fā)酵培養(yǎng)基的基質。②發(fā)酵培養(yǎng)基(fermentation medium):用于生產(chǎn)預定發(fā)酵產(chǎn)物,一般碳源含量往往高于種子培養(yǎng)基。大規(guī)模生產(chǎn)時,原料應價廉易得,還應有利
24、于下游的分離提取。,5. 根據(jù)培養(yǎng)目的來分,味精生產(chǎn)菌北京棒狀桿菌AS1299:一級種子(用搖床培養(yǎng))培養(yǎng)基配方:,葡萄糖 3%玉米漿 2.5~3.5%尿素 0.3~0.5%K2HPO4 0.1~0.2%MgSO4 0.05%,二級種子(1200升發(fā)酵罐)培養(yǎng)基配方:以水解糖3%代替葡萄糖3%,其他成分相同。,,The powder
25、is weighed and dissolved in a specified amount of water. pH is checked and adjusted. Then the medium is sterilized at 121º C at 15 lbs/sq. in. pressure for 15 minutes. Heat labile compounds that are to be added to t
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