細(xì)胞工程制藥

1、一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室它必須滿足三個(gè)基本的需要，即：,細(xì)胞工程制藥專題二第一節(jié) 細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室技術(shù)2、輔助實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。攝影室及暗室進(jìn)行培養(yǎng)材料的攝影記錄和暗室顯影，有條件可建立。生化分析室以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的的實(shí)驗(yàn)室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，以便對(duì)培養(yǎng)物

2、的有效成分隨時(shí)進(jìn)行取樣檢查。,實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備；無菌操作；控制培養(yǎng)(一) 實(shí)驗(yàn)室組成：基本實(shí)驗(yàn)室、輔助實(shí)驗(yàn)室1、基本實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備室完成培養(yǎng)基配制、洗滌與滅菌等，要求寬敞明亮，通風(fēng)條件好。接種室進(jìn)行無菌操作，要求封閉性好、干燥清潔、能較長時(shí)間保持無菌。房間不宜過大，接種室除了出入口和通氣口外，應(yīng)行密閉。培養(yǎng)室是對(duì)離體材料進(jìn)行控制培養(yǎng)。首要要求是要能控制光照和溫度，其次為防止

3、微生物感染，培養(yǎng)室應(yīng)保持干燥和清潔。(二) 基本設(shè)備配置冰箱3、液氮罐、天平、酸度計(jì)、純水器、電爐、培養(yǎng)基分裝器、攪拌器、振蕩器、離心機(jī)滅菌設(shè)備(蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈)無菌操作設(shè)備(凈化工作臺(tái)、接種箱)光溫控制設(shè)備(時(shí)間程序控制器、空調(diào)及溫度感應(yīng)器)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備(培養(yǎng)架、培養(yǎng)箱、搖床、生物反應(yīng)器等)細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備(光學(xué)研究顯微鏡、實(shí)體顯微

4、鏡、倒置顯微鏡) 有條件可配制攝影設(shè)備、生化分析設(shè)備等。,1,二、基本技術(shù)(一) 洗滌技術(shù)1、洗滌液鉻酸洗滌液是用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)與硫酸(H2SO4)配制而成，可根據(jù)需要配制成弱、中、強(qiáng)三種。2、洗滌方法玻璃器皿洗滌塑料用品洗滌金屬用品洗滌幾種常用消毒劑的效果比較,(二) 滅菌、消毒技術(shù)物理方法：高壓蒸汽滅菌、紫外照射化學(xué)方法：消毒劑、抗菌素滅菌,消毒劑,使

5、用濃度/%,清除難易 消毒時(shí)間/min 滅菌效果,次氯酸鈉次氯酸鈣漂白粉升汞酒精過氧化氫溴水硝酸銀抗菌素,29-10飽和溶液0.1-170-7510-121-214-50 mg/L,易易易較難易最易易較難中,5-305-305-302-100.2-25-152-105-3030-60,很好很好

6、很好最好好好很好好較好,第二節(jié) 植物細(xì)胞工程制藥,2,一、發(fā)展歷史細(xì)胞學(xué)和細(xì)胞全能性學(xué)說為組織培養(yǎng)技術(shù)的產(chǎn)生奠定了理論基礎(chǔ)。? Schleiden和Schwann分別于1838年和1839年提出細(xì)胞學(xué)說(cell theory)：細(xì)胞是有機(jī)體，亦是生物體的基本結(jié)構(gòu)單位，由它構(gòu)成整個(gè)生物個(gè)體。? 是1902年德國著名植物學(xué)家G. Haberlandt在細(xì)胞學(xué)說的基礎(chǔ)上提出細(xì)胞全能性學(xué)說

7、。所謂植物細(xì)胞全能性(totipotency)是指每一個(gè)活細(xì)胞都具有產(chǎn)生一個(gè)完整個(gè)體的全套基因，在適宜的條件下，細(xì)胞具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。,二、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)建立階段植物組織培養(yǎng)建立了兩個(gè)與培養(yǎng)技術(shù)有關(guān)的重要模式：培養(yǎng)基模式和激素調(diào)控模式。,(一) 植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)方式1、外植體培養(yǎng)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織。用于研究植物的生長發(fā)育、分化和變異；進(jìn)行無性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。2、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：產(chǎn)業(yè)化

8、大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。3、原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細(xì)胞：①比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì)；②便于進(jìn)行細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞；③適宜條件下可產(chǎn)生細(xì)胞壁，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。4、單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。,3,溫度,(二) 植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)條件光照：光照強(qiáng)度、光質(zhì)、光照時(shí)間濕度：培養(yǎng)容器內(nèi)濕度(幾乎100%)，環(huán)境濕度(70～80%)pH值：通常pH值范圍是5.5～6.5

9、，pH4.0以下或7.0以上培養(yǎng)物不能正常生長,(三) 離體培養(yǎng)的營養(yǎng)需求植物離體培養(yǎng)基至少包括無機(jī)鹽、有機(jī)化合物、生長調(diào)節(jié)劑，根據(jù)不同需要附加其它成分。無機(jī)鹽類? 參與機(jī)體的建造,? 構(gòu)成特殊的生理活性物質(zhì)，如植物激素、酶以及酶的活化劑滲透壓,通氣條件有機(jī)化合物糖類：C源、維持培養(yǎng)基的滲透壓，植物組培常用蔗糖維生素：肌醇：促進(jìn)糖類的相互轉(zhuǎn)化和維生素、激素的利用，使培養(yǎng)物快

10、速生長，對(duì)胚狀體和芽的形成有良好的影響腺嘌呤：是合成細(xì)胞分裂素的前體之一，外源添加腺嘌呤有利于細(xì)胞協(xié)調(diào)自身合成細(xì)胞分裂素氨基酸：常用水解酪蛋白、水解乳蛋白等多種氨基酸的混合物,? 維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等? 在發(fā)育過程中，影響組織器官的建成植物激素生長素類：IAA(吲哆乙酸)、NAA(萘乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)和IBA(吲哆丁酸)等。細(xì)胞分裂素類：KT(激動(dòng)素)、

11、BA(6-芐基腺嘌呤)、2-ip(異戊烯酰嘌呤)、玉米素、TDZ(苯基噻二唑基脲)、赤霉素類生長抑制物質(zhì)：ABA(脫落酸)、乙烯、CCC(矮壯素)等有時(shí)也被用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的生長發(fā)育過程天然提取物：椰乳、番茄汁、YE(酵母提取物)、瓊脂等,4,(四) 光照對(duì)器官分化的影響? 激素在細(xì)胞生長發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用光照時(shí)間、強(qiáng)度以及光質(zhì)對(duì)器官分化均有影響；? 離體培養(yǎng)器官分化，大都是通過外源激素而,實(shí)現(xiàn)的? 生長素

12、與細(xì)胞分裂素在離體器官分化調(diào)控中,離體培養(yǎng)的光照作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化狀態(tài)，可能與內(nèi)源激素平衡有關(guān)，而不是合成光合產(chǎn)物,占有主導(dǎo)地位三、植物細(xì)胞工程應(yīng)用(一) 藥用植物育種方面的應(yīng)用獲得特殊種質(zhì)材料，縮短育種周期；快速獲得特殊倍性材料；克服遠(yuǎn)緣雜交不親和、雜種胚早期夭折；導(dǎo)入外源基因；種質(zhì)資源保存種苗脫病毒與快速繁殖。5,(二) 次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)

13、1、植物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類型植物次生產(chǎn)物種類繁多（據(jù)保守估計(jì)已超過2萬種），根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同大致分為：酚類化合物－黃酮類、單酚類醌類（苯醌、萘醌、蒽醌）萜類化合物－三萜皂甙、甾體皂甙、單萜、倍半萜、二萜含氮化合物－生物堿、胺類（伯、仲、叔、季胺）、非蛋白質(zhì)氨基酸、生氰甙、多炔類、有機(jī)酸等次生代謝物的研究主要集中在一些珍稀、瀕危、藥效明顯、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高,的藥用

14、植物的次生代謝物生產(chǎn)方面。紫杉醇(Paclitaxel)是繼阿霉素和鉑類抗癌藥之后最受重視的一種抗癌新藥，是一新發(fā)現(xiàn)的有絲分裂抑制劑，其作用機(jī)理在于阻止微管正常生理聚集，抑制癌細(xì)胞的有絲分裂和紡錘體的形成，從而使癌細(xì)胞的復(fù)制受到阻斷而凋亡。1967年美國化學(xué)家Wall和Wani等首先從太平洋紫杉(短葉紅豆杉，Taxus. Brevifolia)樹皮中提取出來。該藥于1990年進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，1992年底獲美國,

15、紫杉醇存在于紅豆杉 屬 植 物 的樹 皮 、 葉 及莖 中 ， 其 中樹 皮 中 的 含量最高，大約從12000株成 年 紫 杉 樹中 才 能 提 取1Kg的紫杉醇，而且紫杉的 生 長 周 期很 長 ， 在 世界 分 布 很 少。 紫 杉 醇 國際市場價(jià)格450美元/g,FDA批準(zhǔn)上市。6,野生新疆雪蓮治療婦科疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等有顯,日本有關(guān)組織從紅豆杉中誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，紫杉醇的含量達(dá)到了0.05%

16、，比樹皮中紫杉醇的含量高達(dá)10倍。Ketchum從6種紫杉醇屬植物中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，獲得了產(chǎn)生紫杉醇的高產(chǎn)細(xì)胞株，在懸浮培養(yǎng)下，細(xì)胞內(nèi)的紫杉醇含量超過了20mg/L。清華大學(xué)化工系生物化工研究所通過固液兩步培養(yǎng)法可以在4周內(nèi)獲得20g/L干物質(zhì)，利用代謝調(diào)控技術(shù)在2~3天內(nèi)將紫杉醇的含量提高到0.063%左右。紫草寧可用作創(chuàng)傷、燒傷以及痔瘡的治療藥物，同時(shí)又因?yàn)槠淦恋淖?/p>

17、紅色而作為高級(jí)色素使用。紫草寧產(chǎn)生于亞洲的多年 生 植 物 紫 草 (Arnebiaeuchroma)的根部。但紫草資,著療效；可防紫外輻射、延緩衰老、抑制癌細(xì)胞增長等。對(duì)雪蓮愈傷組織反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究紫草的人工栽培成活率低，而且直接提取紫草寧的無法滿足市場需求?；瘜W(xué)合成紫草寧的工藝非常復(fù)雜，且最終產(chǎn)率只有0.7%

18、，生產(chǎn)成本昂貴。紫草寧在國際市場上售價(jià)高達(dá)7000美元/kg植物體和細(xì)胞培養(yǎng)紫草寧含量(%干重)比較,源嚴(yán)重不足，在日本，紫草,生產(chǎn)方式,生產(chǎn)周期 含量,已瀕臨滅絕，在我國紫草列入了二級(jí)保護(hù)植物。,完整植株植物細(xì)胞培養(yǎng),2～3年3周,1～214,7,徑,長春花細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物堿，青蒿細(xì)胞生產(chǎn)青蒿,素，喜樹細(xì)胞生產(chǎn)喜樹堿，苦瓜細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)胰島素，三七細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)皂甙和丹參細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮等。已

19、經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的，如通過希臘毛地黃細(xì)胞培養(yǎng)物生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)地高辛、從日本黃連細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)人參皂苷、利用紫草細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫草寧等。東北紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的紫杉醇含量高達(dá)0.09%，是天然品含量的45倍，細(xì)胞培養(yǎng)新疆雪蓮總黃酮含量,2、植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義? 優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料；? 生物毒素的主要來源，用于殺蟲、殺菌，而對(duì)環(huán)境和人畜無害，是理想的環(huán)保產(chǎn)品。3、規(guī)?；?xì)胞

20、培養(yǎng)是生產(chǎn)植物次生產(chǎn)物的理想途,為56.2%，是天然品含量的52.5倍。(三) 培養(yǎng)系統(tǒng)1、懸浮培養(yǎng)系統(tǒng),植物次生代謝產(chǎn)品市場,2、機(jī)械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng),產(chǎn)品成分,用途,年銷售額(億美元),在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上改進(jìn)設(shè)計(jì)：攪拌裝置改葉輪式為螺旋式減少剪切；植物細(xì)胞生長周期長，設(shè)計(jì)加液裝置；,長春花堿 治療白血病,18～20 (美國),設(shè)有通氣裝置滿足植物細(xì)胞生理活動(dòng)需要的新鮮空氣和排,阿嗎靈奎寧致熱素

21、毛地黃,循環(huán)系統(tǒng)障礙治療瘧疾殺蟲劑心臟病,5～25 (全世界)5～10 (美國)20 (全世界)20～55 (美國),出細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害氣體；設(shè)計(jì)有取樣口便于取樣。3、氣壓攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)降低機(jī)械攪拌式剪切，減少轉(zhuǎn)動(dòng)軸對(duì)培養(yǎng)物的污染，缺點(diǎn)是攪拌不均勻。4、旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)系統(tǒng),用于產(chǎn)品中試或必需裂解細(xì)胞獲得目的產(chǎn)物的培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)是控制精確，處理靈活，缺點(diǎn)是培養(yǎng)體積較小。8,(四) 影響植物細(xì)胞培養(yǎng)及次生產(chǎn)物

22、合成的因素1、植物細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成的關(guān)系,生長偶聯(lián)型：產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長成正比中間型：產(chǎn)物僅在細(xì)胞生長下降時(shí)合成非生長偶聯(lián)型：產(chǎn)物合成在細(xì)胞生長停止以后2、影響因素,MedicinalResearchReviews,內(nèi)因：細(xì)胞的遺傳特性、母細(xì)胞外植體的生理狀態(tài)外因：溫度、pH、營養(yǎng)狀況、通氣狀況生長調(diào)節(jié)因子：激素、前體物質(zhì)第三節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞工程制藥9

23、,?,?,?,一、動(dòng)物物細(xì)胞工程的發(fā)展1907年R. Harrison將蛙胚神經(jīng)管區(qū)一片組織移植到蛙淋巴液凝塊中，存活若干星期，長出了軸突(神經(jīng)纖維)，表明利用體外存活組織實(shí)驗(yàn)研究的可能性。1911年Carrel把無菌技術(shù)引到了組織培養(yǎng)技術(shù)中，在不含抗菌素的條件下，雞胚心臟細(xì)胞維持生存了34年，繼代3400次，證明動(dòng)物細(xì)胞可能在體外無限生長。1914年Thomson創(chuàng)立了體外組織培養(yǎng)途徑－器官培養(yǎng)法，以

24、后又被Strangeways和Fell所發(fā)展。1940年Earle建立了無限傳代的C3H小鼠結(jié)締組織細(xì)胞系－L系。1951年Gay建立了第一個(gè)人體細(xì)胞系－人體宮頸癌Hela細(xì)胞系? 動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立和細(xì)胞融合技術(shù)促進(jìn)了動(dòng)物細(xì)胞工程的蓬勃發(fā)展。動(dòng)物克隆技術(shù)的建立1891Heape等人首次報(bào)道了家兔胚胎移植成功，他們把安哥拉家兔胚胎移植給比利時(shí)兔，得到了4只安哥拉家兔。20世紀(jì)3

25、0年代以后在羊、豬、牛等動(dòng)物的胚胎移植上獲得成功。經(jīng)過幾十年的不斷完善和充實(shí)，已成為一項(xiàng)比較成熟的繁殖生物學(xué)技術(shù)。1962年首例報(bào)道克隆動(dòng)物成功，英國學(xué)者Grudon把非洲爪蟾小腸上皮細(xì)胞的核注入同種或異種非洲爪蟾未受精卵(經(jīng)紫外線照射殺死卵細(xì)胞核)中，約有1%的重組卵發(fā)育成為成熟蛙。這一成功開創(chuàng)了由體細(xì)胞培育動(dòng)物個(gè)體的新型實(shí)驗(yàn)途徑。其貢獻(xiàn)在于：證明了動(dòng)物細(xì)胞具有全能性；初步建立了體細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)體系，卵

26、細(xì)胞質(zhì)對(duì)體細(xì)胞核的發(fā)育功能起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，其作用因子可能是細(xì)胞質(zhì)中的mRNA與有關(guān)的蛋白質(zhì)。,過去50年來用于生產(chǎn)流感疫苗的病毒一直是在受精雞蛋(雞蛋胚胎)中培養(yǎng)。對(duì)雞蛋要求嚴(yán)格，只有經(jīng)過認(rèn)證的養(yǎng)雞廠才可以提供此類雞蛋；每只受精雞蛋一次只能注射一個(gè)病毒菌株，但是典型的流感病毒包含三個(gè)菌株。如果為所有人生產(chǎn)流感疫苗的話，則需要數(shù)十億只受精雞蛋，一旦雞蛋有問題，整個(gè)疫苗計(jì)劃就會(huì)失敗。高致病性禽流感的爆發(fā)

27、總讓人擔(dān)心疫苗夠不夠用。流感暴發(fā)時(shí)，很難在短時(shí)間內(nèi)購置數(shù)百萬只雞蛋。細(xì)胞培養(yǎng)法有助于人類靈活應(yīng)對(duì)大規(guī)模暴發(fā)的流感。細(xì)胞培養(yǎng)法可在很小的生產(chǎn)空間，很快地制造出大批純凈的疫苗動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)藥物疫苗：小兒麻痹癥、狂犬、風(fēng)疹、腦炎、乙肝表面抗原、某些癌癥動(dòng)物疫苗：口蹄疫、豬霍亂、馬腦炎、牛痢疾、犬瘟、草魚出血病等酶類藥物：尿激酶、細(xì)胞色素P450、胃蛋白酶、胰蛋白酶等激素：促紅細(xì)胞生成素、絨膜促性

28、腺激素、促黃體激素等干擾素、免疫調(diào)節(jié)因子：轉(zhuǎn)移抑制因子、胸腺素、白細(xì)胞介素等,10,動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)藥物缺點(diǎn)：培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低。優(yōu)點(diǎn)：翻譯后修飾精準(zhǔn)，糖基化與天然產(chǎn)品相似。,哺乳動(dòng)物克隆1981年Illmenses率先報(bào)告用小鼠幼胚細(xì)胞核克隆出正常小鼠。1984年Willadsen用未成熟羊胚細(xì)胞核克隆出一頭羊。1997 年 2 月 英 國 科 學(xué) 家 Wilmut 等 在 世 界 權(quán) 威 雜 志《

29、Nature》上首例報(bào)道了世界第一只克隆羊誕生。實(shí)驗(yàn)證實(shí)哺乳動(dòng)物高度分化的細(xì)胞同樣含有全套遺傳信息，進(jìn)一步證明了動(dòng)物細(xì)胞的全能性。此項(xiàng)技術(shù)因而榮登美國《Science》周刊評(píng)出的1997年十大科學(xué)發(fā)現(xiàn)的榜首。,克隆技術(shù)將對(duì)21世紀(jì)產(chǎn)生的重大影響(1)遺傳素質(zhì)完全一致的克隆動(dòng)物將更有利于開展對(duì)動(dòng)物(人)生長、發(fā)育、衰老和健康等機(jī)理的研究；(2)有利于大量培養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)良的家畜;(3)經(jīng)轉(zhuǎn)基因的克隆哺乳動(dòng)物，能為

30、人類提供源源不斷的廉價(jià)的藥品、保健品以及較易被人體接受的移植器官；,生產(chǎn)藥用蛋白,利用克隆轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物,(4)科學(xué)家將很快地從目前的同種克隆技術(shù)推進(jìn)到異種克隆，即借腹懷胎的新領(lǐng)域，這無疑將大大促進(jìn)對(duì)瀕臨滅種的哺乳動(dòng)物的保護(hù)工作。11,(三) 動(dòng)物細(xì)胞的營養(yǎng)需求,二、動(dòng)物細(xì)胞特性(一) 動(dòng)物細(xì)胞在活體內(nèi)的特性活體內(nèi)的動(dòng)物細(xì)胞按分裂能力分為三大類：能保持

31、繼續(xù)分裂能力的細(xì)胞；永久失去分裂能力的細(xì)胞；靜止細(xì)胞群(二) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境要求溫度、濕度、pH、溶氧及氣體環(huán)境、滲透壓(四) 離體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生理特性1、貼壁生長：大多數(shù)細(xì)胞依靠貼附因子才能在支持物表面生長、增殖。一般形成纖維樣和上皮細(xì)胞樣兩種形態(tài)。2、懸浮細(xì)胞：不依賴支持物，可懸浮生長如血液淋巴細(xì)胞和生產(chǎn)干擾素的Namalwa細(xì)胞等，細(xì)胞呈球形。兼性貼壁細(xì)胞：生長

32、不嚴(yán)格依賴支持物。如中國倉鼠卵巢細(xì)胞，小鼠L929細(xì)胞。3、接觸抑制：動(dòng)物細(xì)胞在支撐物上增殖成片，相互接觸時(shí)停止增殖，即接觸抑制或密度依賴抑制。轉(zhuǎn)化為異倍體后該現(xiàn)象消失，可多層生長。4、正常原代培養(yǎng)primary culture (1~4w)傳代次數(shù)是有限的(10-50代)，異倍化細(xì)胞（傳代過程中自發(fā)轉(zhuǎn)化；病毒或化學(xué)試轉(zhuǎn)化；從腫瘤細(xì)胞中獲?。勖菬o限的，稱無限細(xì)胞系(infinite cellline)

33、，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。5、動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基要求高，對(duì)環(huán)境影響敏感。,1、天然培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn)是營養(yǎng)成分豐富、培養(yǎng)效果好；缺點(diǎn)是成分復(fù)雜、個(gè)體差異大、來源有限。主要包括體液（血清）、組織浸出液（胚胎浸出液）、凝固劑（血漿）、水解乳蛋白等2、合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基主要成分：氨基酸、維生素、糖類、無機(jī)離子和其它輔助成分(五) 動(dòng)物細(xì)胞要求和獲得1、參照美國FDA對(duì)細(xì)胞株的要

34、求，并對(duì)產(chǎn)物中殘留DNA量提出嚴(yán)格要求。2、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得原代細(xì)胞（直接分離于動(dòng)物組織和器官）、繼代細(xì)胞（具備正常細(xì)胞特點(diǎn)），目前應(yīng)用較少；在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?，?jīng)過一定的處理（如分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器皿中，這一過程稱為取材。理論上講各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實(shí)際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個(gè)體的組織容易培養(yǎng)，所以往往較多的是選擇動(dòng)

35、物的胚胎或出生不久的幼齡動(dòng)物的器官和組織。,12,3、常用動(dòng)物細(xì)胞系,W1-38：正常胚肺組織人二倍體細(xì)胞系。核型為2n=46。成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用BME10%小牛血清，pH7.2，倍增時(shí)間24h，有限壽命50代，安全，用于制備疫苗。MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細(xì)胞系。核型為2n=46，屬成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)基加小牛血清。有限壽命42～46代。增殖速度較W1-3

36、8快，對(duì)不良環(huán)境敏感性較W1-38低。對(duì)人的病毒敏感，用于生產(chǎn)疫苗。Vero：從正常成年非洲綠猴腎臟分離。為貼壁的成纖維細(xì)胞，核型2n=60；培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，加5%胎牛血清；用于多瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒增殖。Namalwa：從肯尼亞患有淋巴瘤病人獲取，建成的人類淋巴母細(xì)胞。2.8%的高倍體率，12～14條標(biāo)記染色體。單條X，無Y。培養(yǎng)基為RPM

37、I1640，添加7%胎牛血清。用于生產(chǎn)α干擾素。,CHO-K1：從中國倉鼠卵巢中分離的上皮樣細(xì)胞。核 型 ： 2n=20 ～ 22 。 培 養(yǎng) 基 ： DMEM 培 養(yǎng) 基 ，10%小牛血清，加入脯氨酸。最廣泛利用的工程細(xì)胞。BHK-21：幼倉鼠腎臟中分離的成纖維樣細(xì)胞。核型為2n=44；培養(yǎng)基為DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工

38、程細(xì)胞構(gòu)建。SP2/0-Ag14：鼠雜交瘤細(xì)胞，能耐受8-氮鳥嘌呤20μg/ml，但在含HAT選擇培養(yǎng)基中不能存活。通常用培養(yǎng)基為DMEM，添加10%胎牛血清。用于生產(chǎn)單抗雜交瘤細(xì)胞和抗體。Sf-9昆蟲細(xì)胞：親代細(xì)胞從秋粘蟲的蛹卵組織中分離獲得。它對(duì)苜宿尺蠖核型多角體病毒和其它桿狀病毒高度敏感。通常用的培養(yǎng)基為Grace’s培養(yǎng)基，添加3.3g/L水解乳蛋白和

39、3.3g/L酵母浸液，10%胎牛血清。用于高效表達(dá)外來蛋白制品。,13,4、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選? 病毒載體：桿狀病毒? 穿梭質(zhì)粒載體：在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞都可進(jìn)行表達(dá)? 要求：不致病，重組仍保持轉(zhuǎn)染性，在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)可高效表達(dá)，有可供篩選的標(biāo)記? 重組載體導(dǎo)入細(xì)胞的方法：? 篩選工程細(xì)胞：建立相應(yīng)的篩選系統(tǒng)；克隆和亞克隆進(jìn)行純化? 建立細(xì)胞庫：原始細(xì)胞庫、生產(chǎn)用細(xì)胞庫,三 、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)(一) 準(zhǔn)

40、備工作準(zhǔn)備工作對(duì)開展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應(yīng)給予足夠的重視，準(zhǔn)備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或無法進(jìn)行。準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺(tái)的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試。(二) 細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件1、儀器和設(shè)備:細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備：CO2孵箱；培養(yǎng)器材：培養(yǎng)瓶、純水設(shè)備(細(xì)胞培養(yǎng)

41、液用水經(jīng)石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水，電阻率為1.5×106?·cm或超純水凈化裝置制備的超純水)、除菌設(shè)備、清洗設(shè)備等。2、培養(yǎng)液:常 用 的 基 礎(chǔ) 培 養(yǎng) 液 均 已 商 品 化 ， 如 RPMI1640 、MEM、DMEM、F12等，可根據(jù)培養(yǎng)需求合理選擇。3、血清：一般常用為小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它動(dòng)物血清，含大分子蛋白質(zhì)和核酸等營養(yǎng)物質(zhì)。進(jìn)行藥物

42、和受體及營養(yǎng)等方面的研究使用無血清培養(yǎng)基。,14,4、溫度：,來源不同動(dòng)物細(xì)胞，最適的生長溫度不同。昆蟲細(xì)胞25-28℃，人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞37℃。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力比對(duì)高溫的耐受力強(qiáng)，如溫度升至45℃，1h內(nèi)人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞將被殺死；25-35℃時(shí)，細(xì)胞仍能生長，但速度減慢，并維持長時(shí)間不死，甚至于放在4℃，數(shù)小時(shí)后再置于37℃培養(yǎng)，細(xì)胞仍能繼續(xù)生長。,5、pH值：,動(dòng)物細(xì)胞合適pH值7.2-7.4，低于6.8或高于7.6

43、時(shí)都,對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利的影響，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞退變或死亡。原代培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)pH值的變化耐受性差，傳代細(xì)胞對(duì)pH值變化的耐受性較強(qiáng)。,(三) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)步驟,無菌取出目的細(xì)胞所在組織，用培養(yǎng)液漂洗干凈,以鋒利無菌刀具割棄多余部分，切成小組織塊,將小組織塊置解離液離散細(xì)胞。解離液含蛋白酶類，無鈣、鎂離子,低速離心洗滌細(xì)胞后，將目的細(xì)胞吸移至培養(yǎng)瓶培養(yǎng),15,?,?,?,(四) 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝,始于20世紀(jì)50年代，最初采用成百

44、上千只體積小的培養(yǎng)瓶，后改用滾瓶培養(yǎng)；1967年Van Wezel開發(fā)了適合貼壁細(xì)胞生長的微載體，使動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能夠在攪拌釜式反應(yīng)器中進(jìn)行，現(xiàn)在廣泛應(yīng)用，最大達(dá)2000L規(guī)模；微 載 體 是 直 徑 60-250μm 的微珠：天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等? 先將組織切成碎片，蛋白質(zhì)酶處理而得到單個(gè)細(xì)胞，離心收集細(xì)胞。將

45、細(xì)胞植入營養(yǎng)培養(yǎng)基，使細(xì)胞在培養(yǎng)基中增殖到覆蓋瓶壁表面，用酶把細(xì)胞從瓶壁上消化下來，再接種到若干培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后將細(xì)胞接種于大規(guī)模生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，按照產(chǎn)物的不同形式進(jìn)行產(chǎn)物分離純化。? 對(duì)于積累在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)物，可通過收集細(xì)胞后進(jìn)行破胞，再經(jīng)過分離純化獲得產(chǎn)物；對(duì)于分泌到培養(yǎng)液中的產(chǎn)物，可以通過濃縮、純化培養(yǎng)液來獲得產(chǎn)品；而對(duì)于那些必須加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行培養(yǎng)或病毒感染培養(yǎng)才能得到的產(chǎn)物,19

46、72年Knazek開發(fā)了中空纖維反應(yīng)器，細(xì)胞密度大為提高1978年Lim開發(fā)了細(xì)胞微囊化技術(shù)，將非貼壁依賴性細(xì)胞包含在較小的顆粒狀微囊中，在攪拌釜式或氣升式反應(yīng)器中，可進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)到1986年氣升式反應(yīng)器應(yīng)用于雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單抗，最大達(dá)到10,000L(五) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器1、氣升式細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器氣體混合物從底部的噴射管進(jìn)入反應(yīng)器。氣升式生物反應(yīng)器

47、主要采用內(nèi)循環(huán)式，但也有采用外循環(huán)式。,的細(xì)胞，可加入上述誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)或病毒感染后，收集細(xì)胞，再經(jīng)分離純化得到產(chǎn)物。16,細(xì)胞,生長的細(xì),胞型,胞,過濾器,T,傳感器,泵,與攪拌式生長反應(yīng)器相比，氣升式生物反應(yīng)器產(chǎn)生的湍流溫和而均勻，剪切力相當(dāng)小，反應(yīng)器內(nèi)沒有機(jī)械運(yùn)動(dòng)部件，而細(xì)胞損傷率比較低；同時(shí)由于采用直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高；液體循環(huán)量大，能使細(xì)胞和營養(yǎng)成分均勻地分布于培養(yǎng)基中。在氣升式生物反應(yīng)

48、器中，溶氧的控制可以通過自動(dòng)調(diào)節(jié)進(jìn)入空氣的速率來實(shí)現(xiàn)；pH值可通過在進(jìn)氣中加入二氧化碳或加入氫氧化鈉來控制。,2、中空纖維管生物反應(yīng)器培養(yǎng)基出口空氣與CO2入口中空纖維反應(yīng)器示意圖,既可培養(yǎng)懸浮生長的細(xì)胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞，細(xì)胞的密度最高可達(dá)109/ml數(shù)量級(jí)。控制系統(tǒng)不受污染，可長期運(yùn)轉(zhuǎn)。主要用于工業(yè)化培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體?？諝馀cCO2出口,培養(yǎng)基入口,與培養(yǎng)瓶、滾

49、瓶相比，氣升反應(yīng)器的抗體產(chǎn)量平均提高4.6倍。,分泌的產(chǎn)物,雜交瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、乳腺組織細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、垂體腫瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞、BHK-2細(xì)胞、肺細(xì)胞等IgG、IgM、IgA、干擾素、激素、尿激酶、蛋白質(zhì)C、病毒蛋白、,乙型肝炎表面抗原、T抑制因子、促細(xì)胞生長素、白細(xì)胞介素等4、細(xì)胞灌注培養(yǎng)系統(tǒng),3、流化床生物反應(yīng)器,營養(yǎng)液,收獲,氧氣,液位控制,細(xì),反應(yīng)器液

50、體流速足以使細(xì),胞微粒懸浮不會(huì)損壞脆弱,回流,細(xì),的細(xì)胞。此反應(yīng)器滿足了高密度細(xì)胞培養(yǎng)。既可用,反應(yīng)塔,加熱器,氣體交換,胞懸液,于貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，,又可用于非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)。,PH,DO,CO2,收液新鮮培養(yǎng)基 細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)動(dòng)物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)一般是采用灌注培養(yǎng)。灌注培養(yǎng)連,續(xù)向反應(yīng)器中注入新鮮的培養(yǎng)基，又連續(xù)不斷地取出等量的培養(yǎng)液。通過調(diào)節(jié)灌注速度，可以把培養(yǎng)過程保持在穩(wěn)定的、

51、廢代謝物低于抑制水平的狀態(tài)下。17,灌,注,0,時(shí)間,灌注培養(yǎng)過程的特征,采用灌注培養(yǎng)的優(yōu)越性,細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個(gè)問題,pH、溫度、DO,不僅在于大大提高了細(xì)胞生,1）培養(yǎng)液與培養(yǎng)物的比例合適，不能盲目增加每單位,營養(yǎng)物,廢產(chǎn)物,長密度，而且有助于產(chǎn)物的,體積的細(xì)胞濃度；,表達(dá)和純化。灌注培養(yǎng)已經(jīng)應(yīng)用于許多不同的培養(yǎng)系統(tǒng)中，規(guī)模已達(dá)幾百升。不同培養(yǎng)方式對(duì)CHO細(xì)胞生產(chǎn)人組織血纖維溶酶原激活劑(tPA

52、)產(chǎn)量和活性的影響,2）初培養(yǎng)pH應(yīng)為7.4，培養(yǎng)過程不低于7.0；3）培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液與空間體積之比為1:10。4）培養(yǎng)液體積與表面積的比例為0.2~0.5 ml/cm2。高需氧細(xì)胞在淺培養(yǎng)液(2mm)中生長較好；低需氧細(xì)胞在深培養(yǎng)液(5mm)中生長較好。,細(xì)胞培養(yǎng)方式,分批培養(yǎng) 半連續(xù)培養(yǎng) 灌注培養(yǎng),5）去除死細(xì)胞,純化得率，%純化物質(zhì)的相對(duì)產(chǎn)量比活性，IU/mg tPA,81114.4,211.33391

53、.3,657.74392.6,6）溫度控制：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)溫度變化很敏感，低于36.5℃細(xì)胞生長緩慢；高于37.5℃細(xì)胞存活力降低。,(一) 凍存細(xì)胞的意義,四、細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇為減少污染對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)影響，必須建立細(xì)胞凍存庫。細(xì)胞凍存庫應(yīng)該分主細(xì)胞庫(Master cell bank，,1、長期保存細(xì)胞2、防止細(xì)胞老化3、實(shí)驗(yàn)本身的需要，如單體實(shí)驗(yàn),MCB)和工作細(xì)胞庫(Working cell bank，WCB)。

54、需要實(shí)驗(yàn)時(shí)從主細(xì)胞庫中復(fù)蘇細(xì)胞建立工作細(xì)胞庫。每一個(gè)凍存標(biāo)本都應(yīng)明確記錄細(xì)胞的性質(zhì)、代數(shù)。同時(shí)還應(yīng)建立規(guī)范的檢測程序進(jìn)行菌檢及細(xì)胞鑒定18,①細(xì)胞,(二) 細(xì)胞冷凍的過程和種類細(xì)胞凍存在超低溫(-196℃)的液氮中。冰凍時(shí)加入5~10%的甘油或二甲基亞砜(DMSO)作為冷凍保護(hù)劑。注意細(xì)胞的凍存和融化要“緩凍速融”。(三) 凍存的原理與方法

55、細(xì)胞、組織和器官體外保存技術(shù)的基本原則：? 為了繼續(xù)保持細(xì)胞、組織和器官的活力和延長壽命，必須供給它們營養(yǎng)適宜的生活環(huán)境；? 此外調(diào)整保存液的酸度及降低保存的溫度，借以來減低細(xì)胞代謝能力，以期保全維持細(xì)胞活力的能量產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，從而延長保存期。,凍存細(xì)胞的種類單細(xì)胞（精子、卵、腫瘤細(xì)胞及其他單細(xì)胞保存）血細(xì)胞（紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、骨髓細(xì)胞、干細(xì)胞以及鞣酸化

56、致敏紅細(xì)胞保存）胚胎細(xì)胞②組織：包括皮膚、骨、血管和角膜保存③器官保存：包括腎、肝、肺、心、胰腺、小腸等凍存細(xì)胞的方法慢凍法：將細(xì)胞經(jīng)過高濃度甘油40~50%(V/V)溶液處理后，制成的甘油化細(xì)胞懸液，在-80或-120℃的冰箱中保存，此時(shí)在細(xì)胞外液中生成較大的冰塊。速凍法：,保存細(xì)胞三要素,營養(yǎng)保護(hù)劑低溫,以低濃度甘油或10～18%D

57、MSO(V/V)快速凍存。將細(xì)胞、組織和器官經(jīng)過低濃度低溫保護(hù)劑處理以后灌入容器內(nèi)，置于液氮中凍存，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)也有小冰晶形成。,19,封口,保護(hù)劑種類根據(jù)其是否透過細(xì)胞膜分為兩大類：細(xì)胞內(nèi)（適用于慢速凍存）：甘油、DMSO、葡萄糖、乙二醇、二元醇、三元醇、丙二醇、乙酰胺、甲酰胺、乙醇、甲醇等。細(xì)胞外（適用于快凍保存）：乳糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、聚乙二醇、白蛋白、甘露醇、

58、山梨醇、甜乙醇等。(四) 凍存細(xì)胞的技術(shù)要點(diǎn)? 為保持細(xì)胞最大存活率，一般都采用慢凍快融的方法。? 標(biāo)準(zhǔn)的冷凍速度為：－1～－2℃/min，當(dāng)溫度達(dá)－25℃時(shí)下降速度可調(diào)至5～10℃/min，到－100℃時(shí)則可迅速置入液氮中。,最常用的保護(hù)劑為DMSO和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，使用濃度范圍在5

59、~ 15%之間，常用10%。DMSO既能降低細(xì)胞的新陳代謝，又能維護(hù)膜的強(qiáng)度、使水分不易進(jìn)入細(xì)胞而影響其凍存DMSO無須滅菌處理，因?yàn)镈MSO本身對(duì)細(xì)菌有毒性作用，自身無菌DMSO不適合高壓滅菌或?yàn)V膜過濾。高壓可使其毒性增大，而濾膜可被其溶化凍存過程取對(duì)數(shù)期細(xì)胞(密度為5×106/ml)滴加等體積20%DMSO/培養(yǎng)液，重懸分裝于冷凍管或安培瓶中(0.

60、5-1.5ml/管)降 溫(下降溫度控制在1℃/min),4℃ 30min,冰盒10min,液氮罐氣相 2hr,入液氮,20,凍存條件不當(dāng)造成細(xì)胞破壞的原因：,? 要適當(dāng)掌握溫度下降速度，過快會(huì)影響細(xì)胞,低溫,細(xì)胞內(nèi)形成冰晶,內(nèi)水分透出，太慢則促進(jìn)冰晶形成。不同細(xì)胞對(duì)凍存速度要求不同。? 防護(hù)劑類型和用量也要依細(xì)胞而定。? 原則上細(xì)胞在液氮中可貯存多年。但為了穩(wěn)妥起見，凍存一年之后，應(yīng)再復(fù)蘇培養(yǎng)一次，然后再繼

61、續(xù)凍存。,細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)濃度升高細(xì)胞脫水細(xì)胞失活細(xì)胞由于凍存受到損害的有關(guān)因素：①制冷溫度；,②降溫和復(fù)溫速度；③是否加入冷凍保護(hù)劑(五) 復(fù)蘇方法,①從液氮中取出冷凍管（如為無螺帽冷凍管，應(yīng)防突然爆裂而傷皮膚和眼睛）,利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)糖基化重組蛋白,②立即投入37～40℃水浴中，并振蕩之，使之盡快融化(1～2min)，如不是螺旋蓋冷凍管，則要用鑷子夾住冷凍管，防止水

62、進(jìn)入而造成污染。21,糖鏈對(duì)糖蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響,很多關(guān)鍵的生物過程，如細(xì)胞遷移和細(xì)胞因子作用、腫瘤發(fā)生及發(fā)展、病原微生物感染、免疫反應(yīng)包括炎癥和自身免疫病等，都與以糖鏈為“生物信息分子”的糖蛋白有關(guān)。這些重要作用使得人們對(duì)糖蛋白成為治療各種疾病（如癌癥、傳染病、代謝性疾病和心血管疾病等）的藥物前景充滿希望。蛋白質(zhì)的糖基化修飾,糖鏈對(duì)糖蛋白結(jié)構(gòu)與功能的作用與影響

63、影響糖蛋白質(zhì)合成時(shí)的正確折疊和締合影響糖蛋白的分泌以及穩(wěn)定性和溶解性影響糖蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)影響糖蛋白參與的分子識(shí)別、細(xì)胞識(shí)別影響糖蛋白的生物活性影響糖蛋白藥代動(dòng)力學(xué)影響糖蛋白的免疫原性和抗原性蛋白質(zhì)的糖基化修飾,寡糖鏈生物合成及其與蛋白質(zhì)的共價(jià)連接糖蛋白中寡糖鏈與多肽鏈的共價(jià)連接方式22,7,6,達(dá),系,統(tǒng),蛋白質(zhì)的糖基化修飾

64、,N-糖肽鍵連接糖蛋白的加工過程,重組糖蛋白的基本特點(diǎn)：微不均一性,1,2,3,4,5,多肽鏈中所含糖基化位點(diǎn)的數(shù)目,多肽鏈中所含糖基化位點(diǎn)的類型及其與寡糖鏈的共價(jià)連接方式,Dol-P-P,ENDOPLASMIC RETICULUM,CIS-GOLGI,多肽鏈中所含糖基化位點(diǎn)與寡糖鏈共價(jià)連接的數(shù)目、類型和比例寡糖鏈的類型及外鏈的數(shù)目和結(jié)構(gòu),-UDP11,-UDP10,8,9,-UDP,N-糖鏈,雜核型復(fù)雜型(單、雙、三、四和五

65、天線),O-糖鏈,高甘露糖型,TRANS-GOLGINETWORK,TRANS-GOLGI,MEDIAL-GOLGI,寡糖鏈中單糖的數(shù)量、種類、糖環(huán)類型和糖苷鍵構(gòu)型,Peptide,Glucose,Galctose,N-acetylglucosamine,Mannose,N-acetylneuraminic acid,Fucose,表,糖蛋白藥物不同表達(dá)系統(tǒng)的比較操作簡單，成本低，產(chǎn)率高，無糖基化修飾，操作

66、形成包涵體大腸桿菌外源蛋白占細(xì)菌總蛋白量：胞內(nèi)表達(dá)10~70%操作簡單，產(chǎn)率高，過度糖基化酵 母外源蛋白占菌體總蛋白量為10%左右,Bacteria,Yeast,TransgenicPlants,TransgenicAnimals,NativeGlycoproteins,昆 蟲 細(xì) 胞,產(chǎn)品與天然蛋白質(zhì)相似，表達(dá)水平較高，但其糖基化程度低，形式較為單一,發(fā)酵液中目的產(chǎn)物含量為

67、1~500ｍg/Ｌ準(zhǔn)確轉(zhuǎn)錄后修飾，表達(dá)的糖基化藥用蛋白在分子結(jié),Peptide,Galactose,Mannose,N-glycolylneuraminic acid,構(gòu)、理化性質(zhì)等方面最接近天然蛋白質(zhì)，表達(dá)水平,Xylose,Fucose,N-acetylglucosamine,N-acetylneuraminic acid,CHO 細(xì) 胞,較低,發(fā)酵液中目的產(chǎn)物含量為0.2~200ｍg/Ｌ23,生物技術(shù)藥物的產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)

68、狀,發(fā)展勢頭強(qiáng)勁的生物技術(shù)藥物,美國、歐盟和中國生物技術(shù)藥物的比較,總數(shù),大腸桿菌,酵母,哺乳動(dòng)物細(xì)胞,美國歐盟中國,796527,1817,89,53393,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)和生產(chǎn)的產(chǎn)品是歐美生物制藥的主力軍1993 – 2002年期間生物技術(shù)藥物的全球市場銷售重組糖蛋白在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化中的地位重組糖蛋白和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在生物技術(shù)藥物產(chǎn)業(yè)中的凸顯地位