紫外檢測---(蛋白)凝膠層析法

1、凝膠層析法,,思考題（課前設(shè)疑）,,3.膜分離技術(shù)的原理是什么？它同一般的透析方法相比有何特點？,,,1.層析分離技術(shù)包括哪些技術(shù)？分別敘述凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高壓液相層析、疏水層析、聚焦層析的分離純化原理。,2.一般在粗品制備階段和精品純化階段分別應(yīng)采用哪些層析分離技術(shù)？,4.凝膠層析的應(yīng)用范圍有那幾方面？,5.凝膠層析有何優(yōu)缺點？,6.常用凝膠分那幾類？分別敘述它們各自的應(yīng)用范圍及特點。,7.在實驗中應(yīng)如何選擇凝膠與預(yù)

2、處理？,8.細粒凝膠柱流速慢，洗脫峰越窄，分辨率高，適用于什么產(chǎn)品多分離或分析？粗粒凝膠柱流速高，但洗脫峰平坦，分辨率低，適用于產(chǎn)品制備那個階段的分離？,9.什么是“類分離”和“分級分離 ”？,,10.在凝膠層析中要想得到好的層析結(jié)果應(yīng)注意那些問題和采取那些措施？,11.凝膠用過后，有那幾種保存方法？,12.葡聚糖凝膠離子交換劑，葡聚糖凝膠和離子交換劑有何異同及特點？,,凝膠層析（gel chromatography）常出現(xiàn)多種名稱 ：

3、,如凝膠過濾、分子篩層析、排阻層析、凝膠滲透層析等。,凝膠層析的定義：,凝膠是一種具有多孔、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩。利用這種凝膠分子篩對大小、形狀不同的分子進行層析分離，稱凝膠層析 。,,凝膠層析的應(yīng)用范圍：,凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質(zhì)、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質(zhì)。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開。利用凝膠的分子篩特性，可對這些物質(zhì)的溶液進行脫鹽、濃縮、去熱源和脫色。,凝膠層析的優(yōu)點,凝膠層析

4、具有設(shè)備簡單、操作方便、分離迅速及不影響分子生物學(xué)活性等優(yōu)點。目前已被廣泛應(yīng)用于各種生化產(chǎn)品的分離和純化。,－、凝膠層析的基本原理,,凝膠層析的原理 l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脫開始，小分子擴散進人凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；3 大小分子分開： 4大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進行中,凝膠是一類多孔性高分子聚合物，每個顆粒猶如一個篩子。當(dāng)樣品溶液通過凝膠柱時，相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝

5、膠網(wǎng)孔而只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨著溶劑流動，因此流程較短，向前移動速度快而首先流出層析柱；反之，相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可自由地進出凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動過程中，它們從凝膠內(nèi)擴散到膠?？紫逗笤龠M入另,,,,,一凝膠顆粒，如此不斷地進入與逸出，使流量增長，移動速率慢而最后流出層析柱。而中等大小的分子，它們也能在凝膠顆粒內(nèi)外分布，部分進入顆粒，從而在大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之間被洗脫。這樣，經(jīng)過層析柱，使混合物中的

6、各物質(zhì)按其分子大小不同而被分離。,Vt=Vo+Vi+Vg,Vt=πR2h,,,V。簡稱為外水體積，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脫體積?？梢杂靡粋€已知相對分子質(zhì)量遠超過凝膠排阻極限的有色分子，如常用的藍色葡聚糖-2000溶液通過柱床，即可測出柱床的外水體積Vo。,,Vi簡稱內(nèi)水體積，可由g·Wr求得（g為干凝膠質(zhì)量，單位為g，Wr為凝膠吸水量，以mL／g表示）。Vi也可以從洗脫一種完全不受凝膠微孔排阻的小分子溶質(zhì)（如重鉻酸鉀）

7、的洗脫體積Ve計算，即,Ve＝Vo＋Vi,對某物質(zhì)在凝膠柱內(nèi)洗脫體積Ve、Vo和Vi之間的關(guān)系可用下式表示：,Ve＝Vo＋Kd.Vi,式中Ve為脫體積，它包括自加入樣品時算起，到組分最大濃度出現(xiàn)時所流出的體積。Kd為每個溶質(zhì)分子在流動相和固定相之間的一個特定的分配系數(shù)，它只與被分離物質(zhì)分子大小和凝膠顆粒內(nèi)孔隙大小分布有關(guān)。Kd可通過實驗由Ve、Vo和Vi求得。,,,,,Ve＝Vo＋Kd.Vi,可改寫為：,（Ve-Vo）

8、 Kd=－－－－ Vi,當(dāng)Kd＝0時，Ve=Vo，說明這種溶質(zhì)相對分子質(zhì)量大，完全不能進入凝膠顆粒微孔內(nèi)，被排阻于凝膠顆粒之外而最先洗脫下來；,但實際上，約有1/5的內(nèi)水因溶劑化作用而呈水合狀態(tài)，妨礙小分子的自由擴散。故實際上Ve小分子 ＝Vo＋0.8Vi；當(dāng)0＜Kd＜l時，意味著溶質(zhì)分子只有部分向凝膠顆粒內(nèi)擴散，Kd愈大，進入凝膠顆粒內(nèi)的程度愈大；Kd

9、＝0.5時，其洗脫體積Ve＝Vo十0.5Vi。,當(dāng)Kd＝1時，即Ve小分子 ＝Vo＋KdVi，說明這種溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量小，完全向凝膠顆粒內(nèi)擴散，在洗脫過程中將最后流出柱外。,不同型號葡聚糖凝膠柱床參數(shù),二、凝膠層析的特點,1．凝膠層析操作簡便，所需設(shè)備簡單。有時只要有一根層析柱便可進行工作。分離介質(zhì)—凝膠完全不需要像離子交換劑那樣復(fù)雜的再生過程便可重復(fù)使用。,2．分離效果較好，重復(fù)性高。最突出的是樣品回收率高，接近100％。,,,,4

10、．應(yīng)用廣泛。適用于各種生化物質(zhì)，如肽類、激素、蛋白質(zhì)、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測定等。分離的分子量范圍也很寬，如Sephadex G類為102～105d；Sepharose類為105～108d。,3．分離條件緩和。凝膠骨架親水，分離過程又不涉及化學(xué)鍵的變化，所以對分離物的活性沒有不良影響。,5．分辨率不高，分離操作較慢。由于凝膠層析是以物質(zhì)分子量的不同作為分離依據(jù)的，分子量的差異僅表現(xiàn)在流速的差異上，所以分離時流速必須嚴(yán)

11、格把握。因而分離操作一般較慢。而且對于分子量相差不多的物質(zhì)難以達到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品粘度不宜太高。凝膠顆粒有時還有非特異吸附現(xiàn)象 。,三、常用凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),凝膠層析法常用的凝膠有天然凝膠（如瓊脂粉凝膠）和人工合成凝膠（如葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）。,1．葡聚糖凝膠,葡聚糖凝膠（Sephadex）具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，是目前生化產(chǎn)品制備中最常用的凝膠。,G類葡聚糖凝膠（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是

12、一種以右旋葡萄糖為殘基的多糖，分子間主要是α-1,6-糖苷鍵（約占95%），分枝為l，3-糖苷鍵（約占5%），以1-氯-2，3-環(huán)氧丙烷（見右式）Cl－CH2－CH－CH2為交聯(lián)劑將 O鏈壯結(jié)構(gòu)連接為三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物（下圖）,,,交聯(lián)葡聚糖凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu),葡聚糖凝膠網(wǎng)孔大小可通過調(diào)節(jié)交聯(lián)劑和葡聚糖的配比及反應(yīng)條件來控

13、制。交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，吸水膨脹就越小。交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，吸水膨脹就越大 。,G類葡聚糖凝膠常用G-X代表，X數(shù)字既代表交聯(lián)度，也代表特水量。X數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，適用于分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。X數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，適用于分離高分子生化產(chǎn)品。X數(shù)字也代表凝膠的持水量，如G-25表示1g干膠持水2.5mL，G-100表示 1g干膠持水10mL，依次類推。,2．親脂性葡聚糖凝膠,這種凝膠既親脂又親水，可在多種有

14、機溶劑中膨脹。這種凝膠在pH＞2的不含氧化劑的溶液中穩(wěn)定。用低級醇為溶劑時，對芳香族、雜環(huán)族化合物仍有吸附作用。但用氯仿時則可去除對上述化合物的吸附作用，而對含羥基與羧基的化合物卻有吸附作用 。,國產(chǎn)Sephadex LH－20可用于分子篩層析、吸附層析和分配層析。很適用于脂肪酸、甘油脂、類固醇、維生素、激素類生化產(chǎn)品的分離。洗脫劑可用單一有機溶劑如甲醇、氯仿等，也可用混合溶劑如氯仿與甲醇的混合液。,3．葡聚糖凝膠離子交換劑,在G類凝膠

15、上引入一些酸性或堿性基團后，則制得各種葡聚糖凝膠離子交換劑 。,如引入磺乙基（SE-Sephadex）、羧甲基（CM-Sephadex）及二乙胺基乙基（DEAE-Sephadex A）等。葡聚糖凝膠離子交換劑具有離子交換和分子篩雙重作用。其結(jié)構(gòu)多孔、疏松、非特異性吸附很少，層析時流速易控制，特別適用于蛋白質(zhì)、酶、激素、多核苷酸等的分離純化，以及生化制劑的除熱原。,4．聚丙烯酰胺凝膠,聚丙烯酰胺凝膠也是一種人工合成凝膠，其商品名為生物凝膠

16、P（Bio-gel-P），和交聯(lián)葡聚糖一樣，為顆粒狀干粉，在溶劑中能自動吸水溶脹成凝膠。其由單體丙烯酰胺,和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺,通過自由基引發(fā)聚會形成聚丙烯酰胺凝膠。,（見下圖）。只要控制單體用量和交聯(lián)劑的比例，就能得到不同型號的凝膠。,,聚丙烯酰胺凝膠的結(jié)構(gòu),在聚丙烯酰胺凝膠的合成過程中，單體和交聯(lián)劑的配比可以任意改變。以（T）代表100mL凝膠溶液中含有的單體和交聯(lián)劑總克數(shù)，稱為凝膠濃度。而其中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)劑總量的百分比稱為

17、交聯(lián)度，以（C）表示，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，交聯(lián)度越小，則網(wǎng)孔越大。聚丙烯酰胺凝膠全是由碳一碳骨架構(gòu)成，穩(wěn)定性較好，適合于做凝膠層析的載體。只有在極端pH條件下酰胺鍵才被水解為羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團，故一般只在pH2～11的范圍內(nèi)使用。,像Sephadex一樣，商品聚丙烯酰胺為顆粒狀的干粉，它有十分明顯形成塊狀并粘附在一起的傾向，在溶劑中能自動溶脹成膠。,根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠的溶脹性質(zhì)和分離范圍的不同，可分成10種類型。各種類

18、型均以英文字母P和阿拉伯?dāng)?shù)字表示，從Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P后面的阿拉伯?dāng)?shù)字乘以1000即相當(dāng)于排阻限度（按球蛋白或肽計算）。目前，美國Bio-Rad Laboratories生產(chǎn)并出售多種規(guī)格的Bio-Gel P。,5．瓊脂糖凝膠（Sepharose）,瓊脂糖凝膠（agarose gel）可以分離葡聚糖凝膠和生物膠所不能分離的大分子，使凝膠層析的分離區(qū)間擴大到大分子和病毒顆粒，其最大范圍可達相對分子質(zhì)量1

19、08，但是由于瓊脂有強烈的吸附作用，給使用造成了困難，后來，從瓊脂中分離出兩個組分，一個組分為帶負電荷的瓊脂果膠，含有磺酸基和羧基；另一組分叫瓊脂糖，它不含有帶電基團，其結(jié)構(gòu)是有,β-D-吡喃半乳糖和3，6脫水-L-吡喃半乳糖相結(jié)合的鏈狀多糖。這種瓊脂糖被用來進行凝膠層析，它既具有瓊脂凝膠相同的分離區(qū)間，又沒有吸附作用。但其穩(wěn)定性遠不如葡聚糖凝膠和生物膠P，強酸強堿能引起結(jié)構(gòu)破壞。最好使用條件控制在pH 4～9之間，溫度0～40℃，超出

20、此范圍,可能被破壞。,瓊脂糖凝膠是由瓊脂中分離出來的天然凝膠。它的商品名因生產(chǎn)廠家不同而異。,瑞典的商品名稱為Sepharose，有3種型號，即Sepharose 2B，4B和6B（同中國相同）。阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分含量。,美國的為Bio－GA，有6個型號，即Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯?dāng)?shù)字乘以106表示排阻限度。,。,英國的稱為Sagavac，又分為Sagavac 2F，4F，6F，

21、8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示凝膠中干膠的百分數(shù)，F(xiàn)代表粉末狀，C代表顆粒狀。,丹麥的稱為Gelarose，有5種類型，即2％，4％，6%，8％和10％。,,瓊脂糖凝膠做成珠狀后不再脫水干燥，否則不能再溶脹恢復(fù)原有形狀，因此商品大都以含水狀態(tài)供應(yīng)，并應(yīng)在濕態(tài)保存。一般懸浮在l0-3 mo1/L EDTA和0.02%疊氮化鈉溶液中。百分數(shù)表示干膠量。,四、凝膠層析技術(shù),（一）凝膠的選擇與處理,選擇適宜的

22、凝膠是取得良好分離效果的最根本的保證。選取何種凝膠及其型號、粒度，一方面要考慮凝膠的性質(zhì)，包括凝膠的分離范圍（滲入限與排阻限）還有它的理化穩(wěn)定性、強度、非特異吸附性質(zhì)等；另一方面還要注意到分離目的和樣品的性質(zhì)。,凝膠粒度的大小對分離效果有直接的影響?！銇碚f，細粒凝膠柱流速低，但洗脫峰窄，分辨率高，多用于精制分離或分析等。粗粒凝膠柱流速高，但洗脫峰平坦，分辨率低，多用于粗制分離，脫鹽等。下圖表示在同一流速下不同粒度的Sephadex G

23、-25柱的洗脫效果。,凝膠粒度與洗脫效果的關(guān)系圖,對生物樣品來說，經(jīng)常遇到的是兩種分離形式。一種是只將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如蛋白質(zhì)與鹽類，稱作類分離或組分離。另一類則是要將分子量相差不很大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級分離。后者對實驗條件和操作要求都比較高。下面以最常用的葡聚糖凝膠類為例，分別加以討論 。,,,1．類分離,目的是分開樣品中分子量懸殊的“較大分子組”和“較小分子組”兩類物質(zhì)，并不要求分

24、離分子量相近的組分。,選擇凝膠時，應(yīng)使樣品中大分子組的分子量大于其排阻限，而小分子組的分子量小于滲入限。也就是說大分子的分配系數(shù)Kd= 0，小分子的Kd＝1。這樣能取得最好,的分離效果。例如從蛋白質(zhì)溶液中除去無機鹽。我們知道，蛋白質(zhì)的分子量都大于5000D，而無機鹽的分子量一般在幾十到幾百之間。所以常選用Sephadex G-25凝膠作為分離固定相，因為它的分離范圍是1000～5000D。被分離的兩組物質(zhì)的分子量正好落在分離范圍的兩側(cè)。

25、大分子組為全排阻，而小分子組為全滲入，其Kd值的差可達最大值1。對于分子量小于5000D的肽類進行脫鹽操作則常選用Sephadex G-15凝膠。,2．分級分離,目的是分開分子量不很懸殊的大分子物質(zhì)。選擇凝膠型號時必須使各種物質(zhì)的Kd值盡可能相差大一些。為此，首先決不能使它們的分子量都分布在凝膠分離范圍的一側(cè)，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使組分的分子量盡可能分布在凝膠分離范圍的兩側(cè)，或接近兩側(cè)的位置。如果樣品中含有3個組分的話，最

26、好一個接近全排阻，另一個接近全滲入，,第三個為部分滲入，且分子量大于滲入限的3倍，并小于排阻限的1／3。因為分子量如與滲入限比較靠近，該組分分子在凝膠顆粒中運動所受的約束很小，不易與低分子組分分開。如分子量與排阻限比較靠近則不易與高分子組分分開。如用Sephadex G-200分離血清蛋白質(zhì)的效果要比Sephadex G-150為好。但也有人選用G-150，那是因為G-200強度太低不便操作的緣故（見下圖）。,,不同分離范圍的葡聚糖凝膠

27、上，血清蛋白的層析圖,凝膠顆粒大小一般分為粗、中、細和超細四類。顆粒越細，分離效果越好，因為它容易達到平衡，但流速慢。顆粒越粗，流速越快，會使區(qū)帶擴散，使洗脫峰變平變寬。在一般柱層析中，使用干顆粒直徑在70μm左右較合適。對于在水中保存的凝膠如瓊脂粉凝膠顆粒直徑應(yīng)在150μm左右。凝膠顆粒大小要均勻，這樣流速穩(wěn)定，效果較好。,,,葡聚糖凝膠和生物膠多以干粉形式保存，使用前需用水或洗脫緩沖液充分溶賬。在室溫下讓其充分溶賬脹達到平衡，通常需

28、要較長時間。較快的做法是將干膠往水里加，邊加邊攪，以防凝膠結(jié)塊，然后放到沸水浴中加熱接近100℃，幾個小時就可以使其溶脹，還可起到除去顆粒內(nèi)部氣泡和殺菌作用。,（二）裝柱,一般選用細長的拄作凝膠過濾。進行脫鹽時，柱高50cm比較合適；分級分離時，100cm就足夠了。,一般是在柱內(nèi)先裝入約1/3高度的水或緩沖液，然后將溶脹好的凝膠在攪拌成稀漿的情況下慢慢倒入柱內(nèi)，使其自然沉降。如此連續(xù)操作，可以得到一個均勻的柱床。柱裝得不好往往造成洗脫區(qū)

29、帶加寬，甚至使一些本來可以分開的區(qū)帶重疊。如裝柱時的操作壓力太大，會使凝膠床壓得太實，從而降低流速。,,,層析柱 （a）自制簡易層祈柱（1．玻璃管；2.橡皮塞；3．尼龍網(wǎng)）；（b）普通商品柱；（c）雙底板層析柱（1.洗脫液進出口；2.多孔底板；3．柱床；4．恒溫水進口；5．恒溫水出口；6．可調(diào)節(jié)的塞子）,,,層析系統(tǒng)連接示意圖 1．密封橡皮塞；2．恒壓管，3，恒壓瓶；4，層析流出液，5．可調(diào)蜾旋夾；6.自動收集器；

30、 7.核酸一蛋白質(zhì)檢測儀,,,BS－100自動部分收集器安裝圈1．反全閥；2換管臂；3滴管；4，5換管臂固定螺絲；6.豎桿；7.豎桿囤定螓絲；8報警板；9.試管；10．收集盤；11.時間選揮旋鈕；12.時間選擇固定螺釘；13．自動開關(guān)；14、指示燈；15.電源開關(guān)；16．換向開關(guān)（逆、順）；17．手動開關(guān),新柱裝好后，要用洗脫緩沖液平衡，一般用3～5倍體積的緩沖液在恒壓下流過柱床。,新裝好的柱要檢驗其均勻性－可用帶色的高分子物質(zhì)如藍

31、色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下降。也可以對光檢查，看其是否均勻或有無氣泡存在。,（三）加樣,由于凝膠層析的稀釋作用，似乎樣品濃度應(yīng)盡可能大才好，但樣品濃度過大往往導(dǎo)致粘度增大，而使層析分辨率下降（下圖）。一般要求樣品粘度小于0.01Pa·s（帕斯卡秒），這樣才不致于對分離造成明顯影響。對蛋白質(zhì)類樣品濃度以不大于4％為宜。如果樣品渾濁，應(yīng)先過濾或離心除去顆粒后上柱。分析用量一般為每100mL床體

32、積加樣品1～2mL，制備用量一般為每100 mL床體積加樣品20～30 mL，這樣可使樣品的洗脫體積小于樣品各組分之間的分離體積，獲得較滿意的分離效果。,,樣品黏度對洗脫曲線的影響,（1）加葡萄糖2 000，使終濃度為5%，相對粘度11.8;（2）加葡萄糖2 000，使終濃度為2.5%，相對粘度4.2; （3）加葡萄糖2 000，使終濃度為1%.,樣品與柱床體積比例懸殊時分離效果好，但過少的樣品量不但會造成設(shè)備和器材的浪費，降低工作效率

33、，還會造成樣品稀釋。,樣品上柱是凝膠層析中最關(guān)鍵的一步。理想的樣品色帶應(yīng)是狹窄且平直的巨型色譜帶。為了做到這一點，應(yīng)盡量減少加樣時樣品的稀釋以及樣品的非平流流經(jīng)凝膠層析床體。反之將造成色譜帶擴散、紊亂，嚴(yán)重影響分離效果。,,,,,加樣時應(yīng)盡量減少樣品的稀釋，及凝膠床面的攪動。這一點在分級分離時尤為重要，應(yīng)嚴(yán)格按一定的操作程序進行，通常有下列三種方法：,1．直接將樣品加到層析床表面,2．利用兩種液體比重不同而分層的原理，將高比重樣品加入床

34、表面低比重的洗脫液之中，樣品就慢慢均勻地下沉于床表面，再打開出口，使樣品滲入層析 。,3.可用微量泵控制,（四）洗脫,為了防止柱床體積的變化，造成流速降低及重復(fù)性下降。整個洗脫過程中始終保持一定的操作壓，并不超限是很必要的。流速不宜過快且要穩(wěn)定。冼脫液的成分也不應(yīng)改變，以防凝膠顆粒的漲縮引起柱床體積變化或流速改變。在許多情況下可以用水作洗脫劑，但為了防止非特異吸附，避免一些蛋白質(zhì)在純水中難以溶解（析出沉淀），以及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等問題的發(fā)生

35、，常采用緩沖鹽,,溶液進行洗脫。離子濃度至少0.02mol/L方可獲得較好的結(jié)果，因為凝膠含有少量羧基，會吸附少量陽離子而排斥少量陰離子。洗脫用鹽等介質(zhì)應(yīng)比較容易除去才好，通常，氨水、醋酸、甲酸銨等易發(fā)揮的物質(zhì)用得較多。對一些吸附較強的物質(zhì)也可采用水和有機溶劑（如水-甲醇，水-丙酮等）的混合物進行洗脫。,洗脫劑的流速對分離效果也有很大影響，下圖顯示了同一凝膠柱在不同流速下的洗脫曲線?？梢娸^快的流速下得到的冼脫峰也寬。流速低洗脫峰窄而高。

36、也就是說，流速較低，分辨率較高，樣品稀釋較輕。,流速對洗脫曲線的影響,,,凝膠層析拄洗脫的三部分示意圖,洗脫時的流速與操作壓有關(guān)，與凝膠的型號和粒度也有關(guān)，在同樣的操作壓下洗脫時往往編號小的葡聚糖凝膠，以及顆粒粗的凝膠流速大；編號大的，粒度細的流速慢。對于某種凝膠來說，在一定范圍內(nèi)，操作壓加大，流速加快。對強度較大的凝膠，如Sephadex G-10～50，在相當(dāng)大的柱壓范圍內(nèi)流速（Ⅴ）與操作壓（F）成正比，與柱長（L）成反比：,Ⅴ=

37、K ΔP／L,而對于強度差的凝膠，符合以上公式壓力范圍很小。進一步加大壓力時，由于凝膠顆粒變形流速反而降低．常見的幾種葡聚糖凝膠柱床承受壓力與洗脫流速的關(guān)系見下圖。,幾種葡聚糖凝膠拄床承受壓力圖,,,各種層析柱裝置的操作壓（或靜水壓）（a），（b）操作壓等于柱或貯液器內(nèi)液面和出水接管末端的高度差；（c），（d）壓力的大小是由恒壓瓶內(nèi)空氣入口管的底部至出口接管末端的高度計算。向下（c）或向上（d）移動出水管無關(guān)緊要,欲達到流速恒定的目的

38、，可自制恒壓加液裝置（下圖），更可靠的是使用微量恒流泵。,凝膠層析恒壓加液裝置,,,（五）凝膠的再生和保養(yǎng),在洗脫過程中，所有組分一般都可被洗脫下來，所以裝好柱后，可反復(fù)使用，無需特殊的再生處理。但多次使用后，凝膠顆?？赡苤饾u沉積壓緊，流速變慢。這時只需將凝膠自柱內(nèi)倒出，重新填裝?；蚴褂梅礇_法，使凝膠松散沖起，然后自然沉降，形成新的柱床，這樣流速會有所改善。,葡萄糖凝膠和瓊脂糖凝膠都是碳水化合物，能被微生物（如細菌和霉菌）分解。聚丙烯酰

39、胺凝膠本身不被微生物作用，但微生物還是能在此凝膠液中和凝膠床上生長，這樣會破壞凝膠的特性，影響分離效果。為防止細菌生長和發(fā)酵，可用0.02％疊氮化鈉、0.05%三氯叔丁醇（僅在弱酸有效，也適用于其他離子交換劑）或0.002％洗必泰、0.01％醋酸苯汞（在弱堿中有效，也適用于其他陰離子交換劑）以及0.1mol／L氫氧化鈉溶液等作防腐劑。層析前再用水或平衡液將防腐劑洗去。,,,,凝膠用過后，有幾種保存方法：,濕態(tài)保存：在水相中加防腐劑，或水

40、洗到中性，高壓滅菌封存（或低溫存放）；,半收縮保存：水洗后濾干，加70％乙醇使膠收縮，再浸泡于70％乙醇中保存；,干燥保存：水洗后濾干，依次用50％、70％、90％、95％乙醇脫水，再用乙醚洗去乙醇，干燥(或60～80℃烘干）后保存。加乙醇時，切忌一上來就用濃乙醇處理，以防結(jié)塊。,紫外檢測儀及記錄儀,紫外檢測儀是生物大分子液相色譜中常用的檢測儀器，可用于連續(xù)測量液體流的紫外吸收，用與其相連接的記錄儀記錄下吸光值的變化情況，廣泛應(yīng)用于生

41、物大分子的分離純化。,一.北京新技術(shù)所生產(chǎn)的紫外檢測儀及記錄儀的使用：,1．儀器的連接：紫外檢測儀出廠時安裝280nm濾光片，使用前應(yīng)確認波長轉(zhuǎn)換開關(guān)在280nm處。用信號線將紫外檢測儀和記錄儀連接，分別開啟電源。層析柱出口的導(dǎo)管接到檢測儀的進樣口（下口），檢測儀的出樣口（上口）與樣品收集裝置連接。,2．紫外檢測儀的預(yù)熱：將檢測儀量程旋鈕至T檔位置，預(yù)熱約1h。,3．記錄儀的調(diào)整：,（1）檢測儀的輸出電壓為100mV，所以記錄儀的量程放

42、在100mV；,（2）按下輸入鍵，記錄儀輸入短路，用zero旋鈕調(diào)節(jié)0mV，彈起zero鍵，與檢測儀輸出連接。注意在測定過程中保持記錄儀和檢測儀的連接狀態(tài)，不能再調(diào)zero旋鈕；,（3）調(diào)整紙速2cm/h，開始記錄時放下記錄筆，按下開始鍵。,4．檢測儀的調(diào)整：,(1) 當(dāng)緩沖液流入吸收池后，將靈敏度旋鈕撥到T，調(diào)節(jié)透過率旋鈕，使輸出信號在90—95mV之間；,5．實驗完畢將記錄筆抬起，按下記錄儀紙速快鍵，使記錄圖譜走出，小心取下圖譜，勿

43、將記錄紙錯位，切記將紙速還原。,(2) 將靈敏度旋鈕調(diào)節(jié)到所用的A檔（使吸收峰的高度適中），調(diào)節(jié)吸光值旋鈕，使輸出在5mV左右，即可進行吸光值測定。在測定過程中各調(diào)節(jié)旋鈕不要再動，測定完畢將量程旋鈕調(diào)回T檔位置。,二.Amersham生產(chǎn)的紫外檢測儀及記錄儀的使用：,1．儀器的連接和預(yù)熱：同上,2．記錄儀的調(diào)整：,(1) 記錄儀的量程放在10mV；,(2) 按下zero鍵，調(diào)節(jié)adjust旋鈕使記錄筆至記錄紙的右端，注意實驗記錄時zer

44、o鍵必須處于彈起位置；,(3) 調(diào)整紙速0.5mm/min，開始記錄時按下pen up-down鍵放下記錄筆，按下rec. off-on鍵開始記錄。,,（2）將靈敏度旋鈕撥到SHORT，用記錄儀的調(diào)零旋鈕調(diào)零；,（3）將靈敏度旋鈕撥到2，用zero旋鈕調(diào)整記錄儀基線，將靈敏度旋鈕撥到合適的靈敏度范圍，用zero旋鈕微調(diào)記錄儀基線,4．實驗完畢將記錄筆抬起，按下feed▼鍵，使記錄圖譜走出，小心取下圖譜，勿將記錄紙錯位。,（1）當(dāng)緩沖液流

45、入吸收池后，將AU/%T開關(guān)撥到AU,3．檢測儀的調(diào)整：,五.V。和Vi的測算,層析用凝膠柱在使用前一般都應(yīng)了解其V。和Vi的大小。對分析用柱尤其是這樣。穩(wěn)定的凝膠拄床，V。通常占柱床總體積Vt的30％左右。V。太大則說明柱床沒有達到穩(wěn)定。對于相同型號凝膠所裝的凝膠柱來說，粗顆粒者的V。往往比細粒者為大。,1．V。及Vi的測算,,（1） 重量法,已知：,Vt＝V0十Vi十Vg＝π/4·d2h,Vi=g·Wr,式中g(shù)為

46、干膠重量，Wr為“得水率”，即每克干膠之吸液量。,所以 ：,V。=Vt－（Vi十Vg）,但這種算法不夠準(zhǔn)確，主要原因是Vg難以計算，它和凝膠的水化程度有關(guān)。一般粗略地將其估算為1cm3／g干膠。,（2） 過柱法,已知物質(zhì)的洗脫體積,Ve＝Vo十KdVi,如用全滲入（Kd＝1）或全排阻（Kd＝0）的物質(zhì)過柱，測量其洗脫體積，便可計算出該凝膠柱的V。值及Vi值。實驗室中最常用的是藍色葡聚糖（Kd＝0）及重鉻酸鉀（Kd＝1），硫酸銨（Kd＝l

47、）等。,,,2．Kd及Kav的測算,當(dāng)測得某物質(zhì)的Ve,并不知道該凝膠柱的柱床總體積Vt，內(nèi)水體積Vi及外水體積Vo時，根據(jù)以下公式不難算出分配系數(shù)Kd和Kav值。,Kd與Kav，，甚至Ve被認為是一種組分（物質(zhì)）對于某一個凝膠柱的特征常數(shù)。在判斷高組分的分離情況，測定分子量以及預(yù)測放大柱床后的洗脫體積方面是很有用的。,3．分辨率,凝膠層析中，兩物質(zhì)（A和B）的分辨率（R）定義為：,,式中WA、WB分別為兩物質(zhì)洗脫峰的體積。也就是說，分

48、辨率與洗脫體積的差值成正比，而與兩物質(zhì)的洗脫峰寬度成反比（下圖）。,,,,洗脫分辨率圖,當(dāng)R值＞1，兩物質(zhì)完全分開。小于l時則不能完全分離。提高分辨率的方法只有增大ΔVe或減小兩物質(zhì)洗脫峰的體積。,因為 VeA＝Vo十KdA·Vi,VeB＝Vo十KdB·Vi,ΔVe＝Vi（KdB—KdA） ＝ΔKdVi,由于ΔKd是常數(shù)，只有增大Vi才能使ΔVe增加。這就是為什么在進行組分分離時要求較大柱床體積的原因。

49、,減少（WA+WB）的方法有濃縮樣品（但粘度不能太大）；選用小粒度凝膠、流速適當(dāng)減慢等。,六.葡聚糖凝膠離子交換劑使用方法,新購進的陽離子交換劑（如CM-Sephadex C-25）為Na型，陰離子凝膠交換劑（如DEAE-Sephadex A-25）為Cl-型，使用前要按一般離子交換劑的使用方法進行轉(zhuǎn)型處理。1g陰離子交換劑約用100mL,0.5mo1/L NaoH溶液浸泡20min后減壓過濾，充分洗滌，再用等量0.5mol／L HCL

50、處理，洗至中和備用。陽離子交換劑lg約用100mL 0.5mol／L HCL浸泡20min后過濾，充分洗滌，再用等量0.5mo1／L NaOH溶液處理20min，洗至中性備用。,將以上處理好的葡聚糖凝膠離子交換劑，用20～30倍量與層析時所用的同種緩沖液浸泡（但濃度要高，如0.1～0.5mol／L），再用同種酸或堿調(diào)節(jié)至所需要pH值，放置1h后，待pH值不變即可減壓過濾。,凝膠離子交換劑保存時，需先轉(zhuǎn)成鹽型。其他使用方法均同G-類葡聚糖

51、凝膠。再次用緩沖溶液充分浸泡、洗滌，除去氣泡后即可上柱。,,七、葡聚糖凝膠在生化物質(zhì)制備中的應(yīng)用,（—）用G類葡聚糖凝膠濃縮高分子生化物質(zhì)。,（二）用G－25脫鹽,（三）測定分子量,,,,,,,激肽放酶釋G-25拄脫鹽,分子量的測定方法有兩種,（1）求解法 為了求得上述方程中的兩個常數(shù)K和C,先以兩個已知分子量的蛋白質(zhì)過柱。設(shè)其分子量分別為M1、M2，洗脫體積分別為Vl、V2，,解方程組：,Ve1=C-KLogM1,Ve2=C- KLo

52、gM2,求得C和K以后，將任何一個待測物質(zhì)的Ve值代入方程便可計算得出其分子量 。,（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 對于特定的測定系統(tǒng)，先以3個以上（最好更多些）的已知分子的標(biāo)準(zhǔn)蛋白（目前已有配套標(biāo)準(zhǔn)蛋白系列產(chǎn)品出售）過柱，測取各自的Ve值。以Ve作縱坐標(biāo)，LogM作橫坐標(biāo)制做標(biāo)準(zhǔn)曲線。在同一測定系統(tǒng)中測出未知物質(zhì)的Ve值便可由標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得分子量。分子量在10 000～150 000之間的球形蛋白用此法測出的分子量誤差在10％左右。對于線性分子的誤

53、差還可大于此值。,如果以Ve／Vo對分子量對數(shù)作圖，同樣也可以得到一個線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。Ve／Vo與柱子大小無關(guān)，也不受吸附效應(yīng)的影響，因此,（四）分離多組分混合物,用葡聚糖凝膠分離多組分混合物除利用分子篩效應(yīng)外，還可以利用某些物質(zhì)與凝膠具有程度不等的弱吸附作用。如用G－25分離催產(chǎn)素和加壓素結(jié)合物。用G－25分離氨基酸混合物等。由于酸性氨基酸受到膠粒部分排斥而先被洗出，而芳香族氨基酸有弱吸附作用故較后排出，堿性氨基酸吸附最強，所以最

54、后排出。,,測定效果較好。蛋白質(zhì)、酶、激素、多肽、多核苷酸、多糖類高分子量生化產(chǎn)品都可以用凝膠過濾法測定分子量。,G-50分離粗制胰島素圖,層析后圓盤電泳圖,經(jīng)葡聚糖凝膠分離粗制胰島素可分出a，b，c三個成分，再經(jīng)圓盤電泳分析，發(fā)現(xiàn)a峰為高分子雜質(zhì)， b峰主要為胰島素原和類似物， c峰為胰島素和類似物,,G－25分離氨基酸混合物圖,八.數(shù)據(jù)處理,一.曲線的制作,將1mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合液上拄，然后用0.025mol/L氯化鉀－0.2mol/

55、L乙酸溶液洗脫。調(diào)節(jié)流速3.0mL/10min，用自動收集器分管收集（3mL/管），核酸－蛋白質(zhì)檢測儀280nm處檢測，記錄洗脫曲線。確定每個標(biāo)準(zhǔn)蛋白的最大峰值。,,凝膠層析拄洗脫的三部分示意圖,同時根據(jù)已測出的Vo和Vi以及通過量柱的直徑和凝膠拄床高度計算出的Vt方便求出Kd和Kav。,Ve—V0 Kd= Vi,,Ve—V0 K

56、av = Vt－V0,,實驗要求；,作標(biāo)準(zhǔn)曲線,1.Ve～1gMr,2．Kd～1gMr,3．Kav～1gMr,4．Ve/Vo ～1gMr,二、測定未知蛋白分子量,按未知蛋白的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上(下圖）查出相應(yīng)的1gMr值，以次確定未知蛋白分子量,,,洗脫體積與相對分子質(zhì)量的關(guān)系,,,,1.大豆蛋白酶抑制劑；2.細丙二聚體；胰蛋白酶原；4.卵清蛋白；5.血清蛋白；6.血

57、清蛋白二聚體；7.IgG；8.甲狀腺球蛋白；9。蔗糖；10.糖原；11.細丙551；12.細丙；13.Rnase;14. α-乳清蛋白；15.肌紅蛋白 上方曲線為G-75；下方曲線為G-100,九.凝膠過濾層析經(jīng)常遇見的問題,1．流速慢,（1）有氣泡、出水管阻塞,（2）沒打開夾子,（3）柱壓太緊（操作壓過大、長期使用、接頭漏氣）,2．拄內(nèi)產(chǎn)生氣泡,（1）上水口不流或皮管破裂，洗脫液外流,（2）接口漏氣，如上水口螺絲擰的不