dns-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析凝膠層析分離血紅蛋白和魚精蛋白

1、實驗七： DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析凝膠層析分離血紅蛋白與魚精蛋白,背 景,層析法也稱色譜法，是1906年俄國植物學家Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”（Chromatography) 。后來無色物質也可利用吸附柱層析分離。英國生物學家Martin和Synge。他們首先提出了色譜塔板理論。1944年出現(xiàn)

2、紙層析以后，層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)薄層層析、親和層析、凝膠層析、氣相層析、高壓液相層析等。,葉綠素通過碳酸鈣管柱所形成的色譜圖,層析的兩種相,固定相：固定相是層析的一個基質。它可以是固體物質（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動相。

3、在柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。層析法是利用混合物中各組分物理化學性質的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，即各組分所受的固定相的阻力和流動相的推力影響不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。,按層析過程的機理分類：分配層析: 根據(jù)不同組分在不同溶劑中分配系數(shù)不同而使物質分離的方法稱為分配層析。

4、吸附層析:吸附是兩相成一界面，溶質在表面密集的現(xiàn)象。以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達到分離目的的一種層析技術稱為吸附層析。常用吸附劑：活性碳、硅。離子交換層析: 是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質酸堿度、極性和分子大小差異而將物質予以分離的一種方法。凝膠層析（分子篩）利用凝膠顆粒形成具有三維空間多孔性網絡結構的物質，不帶電荷，可起濾過或“篩”的作用。親和層析是利用生物分子間所具有的專一性親和力的層析技術。,

5、層析法分類,層析法分類,按兩相所處的狀態(tài)分類：流動相有兩種狀態(tài)：液體作為流動相 氣體作為流動相固定相也有兩種狀態(tài)：固體吸附劑作為固定相 以吸附在固體上的液體作為固定相按兩相所處的狀態(tài)分為：液相層析和氣相層析,層析法分類,按操作形式不同分類：,吸附層析,原理：任何兩個相都可以形成表面，其中一個相的物質或溶解在其中的溶質在此表面密集現(xiàn)象稱為吸附，利用吸附劑對不同物質具有不同吸附力使混合物得到分的現(xiàn)象就叫吸附層析。凡能將其他物質聚

6、集到自己表面的物質稱吸附劑，包括硅皮、氧化鋁、活性炭、淀粉、纖維素及陶土，而聚集于聚集于吸附劑表面的物質稱被吸附劑。吸附劑與被吸附劑之間的作用除了物理作用外，還有化學作用，如DNS-氨基酸雙向聚酰胺薄膜層析時中被分離的物質之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于二者之間形成氫鍵。,分配層析技術 （液-液層析法）,原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動相）之間的分配系數(shù)的不同而達到分離各組分的目的。紙層析是最廣泛的一種分配層析。

7、特點：液-液層析法適合于分離同系物或同分異構體,分配層析技術,分配系數(shù)小的溶質在流動相中分配的數(shù)量多，移動快；分配系數(shù)大的溶質在固定相中分配的數(shù)量多，移動慢。因此可彼此分開。分配系數(shù)主要與下列因素有關： ① 被分離物質本身的性質； ② 固定相和流動相的性質； ③ 層析柱的溫度。,相關的概念（一）： 分配系數(shù)：當一種溶質分布在兩個互不相溶的溶劑中時，它在固定相和流動相兩相內的

8、濃度之比是個常數(shù)，稱為分配系數(shù)(Kd)。分配系數(shù)是層析中分離純化物質的主要依據(jù) Kd=Cs/Cm 其中Cs: 固定相中的濃度，Cm: 流動相中的濃度,分配層析技術,相關的概念（二）：遷移率：在一定條件下，在相同的時間內某一組分在固定相移動

9、的距離與流動相本身移動的距離之比值。常用Rf來表示。物質在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的， Rf值也是恒定的，因此可以根據(jù)Rf值來鑒定被分離的物質。,原理聚酰胺薄膜層析是一類特殊的分配層析?；旌衔镫S流動相通過聚酰胺薄膜時，由于被分離物質與薄膜形成氫鍵，而各物質形成氫鍵的能力不同，決定吸附力的差異，吸附力強,展層速度慢，吸附力弱，展層速度快。展層溶劑與被分離物質與聚酰胺薄膜表面的離子競爭形成氫鍵，選擇適當?shù)恼箤尤軇?，使被分離物質在溶劑

10、與聚酰胺薄膜表面之間的分配系數(shù)有最大差異。易溶于展層劑的所受的動力作用大，展層速度快，反之，速度慢。,DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析,本實驗中，聚酰胺上的氨基與氨基酸（AA）的羰基形成氫鍵，酰胺基團上羰基與AA中羥基或酚基形成氫鍵。由于有些AA結構相似，如只采用一種溶劑系統(tǒng)進行單向層析，難達到完全分離的目的。因此可選擇另一溶劑系統(tǒng)進行第二向層析。這種層析方法稱為雙向層析。

11、 第一向：苯－冰醋酸溶劑 第二向：甲酸－水顯色：二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）可與氨基酸的游離氨基結合成DNS-氨基酸。形成的DNS-氨基酸在紫外光下呈黃色熒光。,實驗操作,DNS-氨基酸的制備（已完成）混合DNS－氨基酸的雙向層析點樣：在薄膜右下角距兩邊各0.6cm，直徑控制在2～3mm之間，點在無光

12、澤面，可重復點樣2-3次；苯－冰醋酸層析：將點好樣品的薄膜用回形針固定放入展層劑中，展層劑前緣在距薄膜頂端2mm處即可停止,冷風吹干，紫外燈下觀察；甲酸－水層析：調轉90度與第一相垂直，放入展層劑中，熱風吹干，紫外燈下觀察，用鉛筆輕輕標記（以免損壞薄膜表面）；分析實驗結果；將層析后標記好的薄膜以點樣點為左下角貼于實驗報告中。,3、操作注意事項：嚴格控制點樣位置以及點樣直徑。展層時勿將點樣點浸入展層劑中。展層后必須經電吹風將

13、膜吹干。紫外光對眼睛有害不要把頭伸到燈下觀察。,DNS-氨基酸的雙向層析預期實驗結果,凝膠層析技術,概念：凝膠層析又稱分子篩層析、排阻層析，當生物大分子隨流動相通過裝有作為固定相的凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進行分離的技術。原理：凝膠顆粒內部具有多孔性網狀結構，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內外，在

14、柱內經過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。,凝膠層析的原理分子大小不同混合物上柱； 洗脫開始，小分子擴散進人凝膠顆粒內，大分子被排阻于顆粒之外；大小分子分開： 大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進行中。,,凝膠顆粒是一類具有三維空間多孔性網絡結構的物質，不帶電荷，可起濾過或“篩”的作用。,凝膠層析的基本概念,外水體積是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動相的體積。內水體積是指凝膠顆粒中孔穴

15、的體積，凝膠層析中固定相體積就是指內水體積。基質體積是指凝膠顆粒實際骨架體積。柱床體積就是指凝膠柱所能容納的總體積。洗脫體積是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。我們設柱床體積為Vt，外水體積為Vo，內水體積為Vi，基質體積為Vg，則有：Vt＝Vo＋Vi＋Vg 由于Vg相對很小，可以忽略不計，則有：Vt＝Vo＋Vi,,凝膠層析柱各種體積示意圖（陰影部分）,當分子的Kd＝0時，Ve＝Vo即該分子被完全排阻于凝膠顆粒之外

16、，全部分布于流動相里，固定相里分布為零（A)；當分子的Kd＝1時，Ve＝Vo+Vi即該分子完全不被排阻，均勻的分布在流動相和固定相里，兩相比值為1(C)；當0 < Kd <1時， Ve = Vo + Kd*Vi即表明分子受到部分排阻(B)。,實驗原理由于Hb（紅色，分子量64500）與二硝苯-魚精蛋白（黃色，分子量2000-12000）的分子量不同，通過交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50（sephadex）層析柱用蒸餾水洗脫分離。

17、從顏色不同可直接觀察到血紅蛋白洗脫較快，魚精蛋白洗脫較慢。,凝膠層析分離血紅蛋白與魚精蛋白,G類葡聚糖凝膠（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一種以右旋葡萄糖為殘基的多糖，分子間主要是α-1,6-糖苷鍵（約占95%），分枝為l,3-糖苷鍵（約占5%），以1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷為交聯(lián)劑將鏈狀結構連接為三維空間的網狀結構的高分子化合物。,葡聚糖凝膠網孔大小可通過調節(jié)交聯(lián)劑和葡聚糖的配比及反應條件來控制。交聯(lián)度越大，網孔越小，

18、吸水膨脹就越小。交聯(lián)度越小，網孔越大，吸水膨脹就越大。G類葡聚糖凝膠常用G-X代表，X數(shù)字既代表交聯(lián)度，也代表特水量。X數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，網孔越小，適用于分離低分子質量生化產品。X數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，網孔越大，適用于分離高分子生化產品。X數(shù)字也代表凝膠的持水量，如G-25表示1g干膠持水2.5ml，G-100表示 1g干膠持水10ml，依次類推。,裝柱前準備: 先用自來水洗凈,再用蒸餾水洗凈,之后往層析柱加入2-3ml蒸餾水,以

19、確保凝膠底部沒有氣泡；裝柱：垂直裝柱，待凝膠裝至柱高的10-15cm即可（裝柱的時候注意要不斷混勻凝膠）。注意防止氣泡與分層, 否則重新裝柱?？捎貌０魯嚢枋贡砻嫫秸?；平衡：反復加蒸餾水,平衡10分鐘.使蒸餾水維持在3-4cm高度；加樣：待蒸餾水流至柱平面時（不可使柱平面干掉），馬上靠近柱平面小心滴加4滴樣品（注意盡量不要使床面攪動），待樣品浸入到凝膠中后馬上加入3－4滴蒸餾水(動作輕柔)，反復兩次，然后加大量蒸餾水洗脫；收集樣品

20、：樣品一旦加入后馬上用量筒收集流出液，注意向柱床上不斷加水，記錄紅色流出一半時的毫升數(shù)（血紅蛋白的Ve，也即Vo），繼續(xù)收集，記錄黃色流出一半時體積（魚精蛋白Ve）；,實驗操作,思考題,按層析過程的機理分類，DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析屬于分配層析、吸附層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層析法的哪一種？試述其機理？經測定甲蛋白Kd=0，乙蛋白kd=0.75，試問（1）甲乙二蛋白哪一先從凝膠層析柱上洗脫下來？甲乙兩蛋白分子量哪個大