氨基酸的分離鑒定(紙層析法)

1、氨基酸的分離（紙層析法）一、實驗原理1、層析法又稱色譜法，是一種物理的分離方法。利用混合物中各組分物理化學性質的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分以不同程度分布在固定相和流動相兩相中，并使各組分以不同速度移動，從而得到有效的分離。操作方式：紙層析、薄層層析、柱層析等分離機理：分配層析、吸附層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層析等2、紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法，展層溶劑由有機溶劑和水組成。濾

2、紙纖維上的羥基具有親水性，在濾紙上水就被吸附在纖維素的纖維之間形成固定相。當有機溶劑（流動相）沿紙流動經(jīng)過層析點時，層析法上溶質就在水相和有機相之間不斷進行分配。由于溶質就在水相和有機相之間不斷進行分配。由于溶質中各組分的分配系數(shù)不同，移動速率也不同，因而可以彼此分開。分配系數(shù)=溶質在固定相中的濃度溶質在流動相中的濃度物質被分離后在濾紙上的移動速率用值表示：=原點到層析點中心的距離原點到溶劑前沿的距離只要條件（如溫度、展層溶劑的組成）不

3、變，值是常數(shù)，故可根據(jù)值作定性依據(jù)。氨基酸無色，利用茚三酮反應，可將氨基酸層析點顯色作定性、定量用。二、實驗器材標準氨基酸溶液、濾紙、層析缸、保鮮膜、剪刀、毛細管、電吹風。三、實驗試劑1、酸相溶劑：V[正丁醇（A.R）]：V[88%甲酸]：V[水]=15：3：22、顯色貯備液：V（0.4molL茚三酮異丙醇）：V（甲酸）：V（水）=20：1：5四、實驗操作1、點樣量取30mL層析溶劑、1mL顯色貯備液于層析缸中，混勻密閉，靜置。戴好手套

4、，在桌上鋪好一層保鮮膜。取一張干凈濾紙，將其剪彩為18cm14cm。在紙的一端距邊緣2cm處用鉛筆輕輕劃一條直線，在此直線上等距離分出幾個點作為點樣原點。用毛細管將標準氨基酸和未知樣品分別點在點樣點上，每次點樣后用電吹風冷風吹干再點下一次，點樣點直徑不超過5mm。2、層析與顯色將濾紙卷成圓筒形，用釘書針固定成圓筒狀，紙的兩邊不能接觸。將濾紙垂直放入盛有展層劑的層析缸中，迅速蓋緊層析缸蓋（點樣點的一平，也不可能出現(xiàn)斑點朝向不一致的現(xiàn)象。將

5、有層析結果的濾紙放置兩天后，變成了以下情形：圖中顯示，層析溶劑出現(xiàn)了明顯的分層（水相和有機相），可能是因為層析缸內壁有較多水，破壞了溶劑的比例。由于正丁醇與水的互溶有一定限度，過多的水與有機相無法互溶。到層析后期，有機相大部分到濾紙上時，水相開始接觸濾紙并向上移動。由于水相的存在切斷了有機相與下方溶液的通路，有機相無法再向上移動，而水相不斷在擴大其“勢力范圍”。因為有機相無法繼續(xù)上移，有機相中溶解的氨基酸也無法隨溶液移動，因此值也測不準

6、確。由圖可以看出，層析斑點的形狀與水相和有機相的分界線輪廓匹配，從而解釋了為何斑點的朝向不一致。因為到層析后期，層析速度慢的氨基酸只能停留在水相與有機相的交界處。5、實驗總結與改進：1）在做紙層析時，應嚴格保證展層劑各組分的比例，因為值與展層劑的組成密切相關，且比例不對時還可能引起展層劑分層，嚴重影響實驗結果。2）將紙筒放入層析缸時一定要小心放平，否則層析方向會偏，后續(xù)測量層析點到原點的距離時容易產(chǎn)生誤差。3）實驗時一定要避免用手直接接