氨基酸的分離紙層析法

1、生物化學(xué)實驗,張積森（zjisen@gmail.com),,生物化學(xué)(Biochemistry)：研究生命物質(zhì)的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)及生命活動過程中各種化學(xué)變化的基礎(chǔ)生命科學(xué).化學(xué)生物學(xué)（Chemical Biology)：利用化學(xué)手段研究生物學(xué)問題或利用生物學(xué)手段解決化學(xué)問題.,,,Introduction,A Multidisciplinary Science,生物化學(xué)實驗,介紹生物化學(xué)實驗的原理和方法動手! 使用各種生

2、物化學(xué)實驗儀器，掌握生物化學(xué)的各種基本實驗方法和操作技能加深對生物化學(xué)理論知識的認識和理解。,What should we get,設(shè)計一個實驗的基本思路，根據(jù)掌握的實驗基本原理，嚴密地組織自己的實驗，合理地安排實驗步驟和時間－－去解決所需要解決的問題。,生化實驗四大 必殺技,離心電泳層析光譜,What should we do,預(yù)習(xí)：操作：安全&什么是動手能力強？記錄：Raw Data總結(jié)：,實驗記錄,實驗前預(yù)習(xí)

3、，了解要學(xué)習(xí)的主要內(nèi)容。實驗中要詳細記錄實驗條件，如使用的儀器型號、編號、生產(chǎn)廠等；生物材料的來源、試劑的規(guī)格、試劑的濃度等。實驗中應(yīng)及時準確地記錄所觀察到的現(xiàn)象和測量的數(shù)據(jù)。即使觀測的數(shù)據(jù)相同或偏差很大，也都應(yīng)如實記錄，不得涂改,實驗報告（A4大小紙，計算成績！),實驗?zāi)康?實驗原理 儀器、材料和試劑 實驗步驟 結(jié)果討論（含數(shù)理據(jù)處） 注意事項,成績,考勤課堂表現(xiàn)實驗報告筆試實際操作考試,實驗一 氨基酸的

4、分離鑒定 ——紙層析法,【實驗?zāi)康摹?學(xué)習(xí)氨基酸紙層析法的基本原理掌握氨基酸紙層析的操作技術(shù),紙層析法屬于分配層析，它是以層析濾紙為載體，以吸附于濾紙纖維羥基上的一層水（極性）為固定相，流動相是有機溶劑，主要是正丁醇（非極性溶劑）。分離氨基酸是根據(jù)不同氨基酸的極性，在固定相和流動相中的分配系數(shù)不同而進行分離的（依據(jù)相似相溶原理）。,【實驗原理】,分配層析: 利用混合物中各組分在兩種不同溶劑中的分配系數(shù)不同而

5、使物質(zhì)分離的方法。分配系數(shù): 是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中的溶解達到平衡時，該溶質(zhì)在兩種溶劑中所具有濃度之比。不同的物質(zhì)因其在各種溶劑中的溶解度不同，因而也就有不同的分配系數(shù)。。,氨基酸被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值(比移值)來表示的。 在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。,【實驗器材與試劑】,1、層析缸

6、2、毛細管 3、喉頭噴霧器 4、培養(yǎng)皿 5、層析濾紙6、鉛筆（直尺）7、分液漏斗 8、吹風(fēng)機,9、 正丁醇10、冰醋酸11、氨基酸標(biāo)準樣品12、氨基酸混合樣品13、0.1%水合茚三 酮正丁醇溶液,【實驗步驟】,1、配擴展劑： 正丁醇：冰醋酸：水= 20ml ：5ml ：15ml 順序：正丁醇→冰醋酸→水，放入分液漏斗中，充分混勻。靜置約10min后分層，放出下層水層，其余的倒入

7、培養(yǎng)皿中。,2. 準備濾紙 取一張層析濾紙，距紙底邊2cm處用鉛筆劃一橫線，沿線每隔2.5cm作一記號為點樣處，點樣處也不要太靠近兩側(cè)邊（約距1.5cm），會產(chǎn)生邊緣效應(yīng)。 3.點樣（順紙紋方向） 用毛細管依次吸取標(biāo)準品氨基酸和混合樣，吸管與濾紙垂直，輕輕接觸紙面，樣品擴散直徑小于3mm。一滴滴完后用冷風(fēng)(低溫）吹干，再點第二次，共點三次。,4.擴展 將點完樣的濾紙兩側(cè)面對齊，用針線縫合，紙的兩邊不能接

8、觸。將點樣后的濾紙直立于培養(yǎng)皿的擴展劑中，（點樣的一端在下，擴展劑的液面需低于點樣線1 cm ）當(dāng)溶劑展層至濾紙上沿2cm處展層結(jié)束，取出濾紙。用鉛筆畫出展層前沿位置，在通風(fēng)櫥中用熱風(fēng)吹干。,5. 顯色 用喉頭噴霧器均勻噴上0.1％茚三酮正丁醇溶液，然后用熱風(fēng)吹干即可顯出各層析斑點。,6. 測量、計算： 分別測量X、Y值，計算各氨基酸的Rf值。 Rf= X÷Y,注意事項,1、手盡量小心接觸濾紙，

9、順紙紋方向?qū)游觥?、吸取樣品的毛細管不可混用。3、點樣圈不能距離紙邊太近，各點之間的距 離不能太近。4、吹干時一定要保證完全吹干。,5、縫合時，濾紙的兩個紙邊不能相互接觸并且底邊應(yīng)對齊，點樣線一面濾紙朝外。 6、點樣時，樣品擴散圈不能過大，直徑小于3mm。7、使用移液管時應(yīng)右手拿管，左手拿吸耳球并用食指堵管口。8、使用移液管時，應(yīng)先看清管的最大刻度，每一格代表多少后再量取。,9、 15ml水是用蒸餾水，在水槽邊的大

10、玻璃瓶中。10、 實驗結(jié)束請清洗實驗玻儀，但不要清洗展層缸及其中的培養(yǎng)皿。11、有機廢液倒入右側(cè)實驗臺上的“廢液收集有機溶劑”大試劑瓶中。12、 實驗結(jié)束, 回收竹夾子、A4復(fù)印紙、電吹風(fēng)。13、實驗報告要寫同組同學(xué)號數(shù)、名字，層析濾紙貼在其中一位同學(xué)的實驗報告上。14、坐椅推入實驗臺下，空出過道。,【結(jié)果分析與討論】 【思考題】,通過本次實驗，討論下列問題：（1）簡述紙層析的原理。（2）判斷氨基酸極性大小順序，討論A

11、A極性與Rf的關(guān)系？（3）什么是Rf值？影響的主要因素是什么？,,展層劑的配制,正丁醇 : 冰醋酸 : 水=20mL : 5mL : 15mL放置分液漏斗中，塞上塞子，充分振蕩，靜置分層。（先混和正丁醇和冰醋酸）棄下層水層。放10mL左右于培養(yǎng)皿中，并置于密閉的層析缸中。,,下次實驗,總氮量的測定－凱氏定氮法（405實驗室）,氨基酸（amino acid）：含有氨基和羧基的一類有機化合物的通稱。生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位，是

12、構(gòu)成動物營養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)。是含有一個堿性氨基和一個酸性羧基的有機化合物。氨基連在α-碳上的為α-氨基酸。組成蛋白質(zhì)的氨基酸均為α-氨基酸。,必需氨基酸（essential amino acid）： 指人體（或其它脊椎動物）不能合成或合成速度遠不適應(yīng)機體的需要，必需由食物蛋白供給，這些氨基酸稱為必需氨基酸。成人必需氨基酸的需要量約為蛋白質(zhì)需要量的20%～37%。共有8種其作用分別是： 　　賴氨酸：促進大腦發(fā)育，是肝及膽的組成成分

13、，能促進脂肪代謝，調(diào)節(jié)松果腺、乳腺、黃體及卵巢，防止細胞退化； 　　色氨酸：促進胃液及胰液的產(chǎn)生； 　　苯丙氨酸：參與消除腎及膀胱功能的損耗； 　　蛋氨酸（甲硫氨酸）：參與組成血紅蛋白、組織與血清，有促進脾臟、胰臟及淋巴的功能； 　　蘇氨酸：有轉(zhuǎn)變某些氨基酸達到平衡的功能； 　　異亮氨酸：參與胸腺、脾臟及腦下腺的調(diào)節(jié)以及代謝；腦下腺屬總司令部作用于甲狀腺、性腺； 　　亮氨酸：作用平衡異亮氨酸； 　　纈氨酸：作用于黃體、乳腺