免疫血液檢測(cè)

1、紅細(xì)胞血型檢測(cè),新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 三全 學(xué)院,主要內(nèi)容,輸血前免疫血液學(xué)檢查鹽水介質(zhì)試驗(yàn)技術(shù)酶處理試驗(yàn)技術(shù)抗球蛋白試驗(yàn)技術(shù)聚凝胺介質(zhì)試驗(yàn)技術(shù)微柱凝集試驗(yàn)技術(shù)吸收放散試驗(yàn)?zāi)种圃囼?yàn),,教學(xué)目標(biāo),掌握輸血前免疫血液學(xué)檢查內(nèi)容掌握鹽水介質(zhì)、抗球蛋白試驗(yàn)、聚凝胺介質(zhì)和微柱凝集試驗(yàn)檢測(cè)方法試驗(yàn)原理、結(jié)果判讀及注意事項(xiàng)熟悉吸收放散、凝集抑制試驗(yàn)了解酶處理試驗(yàn)和紅細(xì)胞血型分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù),第一節(jié)輸血前免疫血液學(xué)檢查,一、受血者標(biāo)本處

2、理二、受血者和供血者ABO和Rh定型三、不規(guī)則抗體的篩選和鑒定四、交叉配血試驗(yàn)五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的規(guī)范化報(bào)告,一、受血者標(biāo)本處理,（一）標(biāo)本的采集（二）標(biāo)本的接受 核對(duì)、詢問(wèn)輸血史、妊娠史等、注明最后一次輸血日期（三）標(biāo)本的要求準(zhǔn)確無(wú)誤來(lái)自受血者和供血者防止受血者血液標(biāo)本稀釋和（或）溶血受血者標(biāo)本須輸血前3天采集；再次輸注時(shí)間隔24h，重新采集標(biāo)本輸血后，受血者和供血者標(biāo)本保存2~8℃至少7天,,1,4,4,2,4,3,

3、二、受血者和供血者ABO和Rh定型,ABO血型鑒定原理,正向定型：已知的特異性抗體（標(biāo)準(zhǔn)血清）檢查紅細(xì)胞的未知抗原,反向定型：已知的血型的標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞檢查血清中的未知抗體,ABO血型鑒定結(jié)果判斷,ABO正反定型不符分析基本程序,首先重復(fù)試驗(yàn)重新采集獻(xiàn)血者與受血者血液標(biāo)本查詢受血者既往病史及輸血史和用藥史等多次洗滌標(biāo)本紅細(xì)胞應(yīng)用抗-AB、抗-A1、抗-H檢測(cè)紅細(xì)胞分析O型篩選細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果,輸血治療的首要步驟組織器官移植新生兒溶

4、血病,ABO正反定型的臨床意義,復(fù)檢正定型血型結(jié)果的準(zhǔn)確性，糾正漏檢、誤報(bào)亞型能夠糾正因疾病原因造成的紅細(xì)胞抗原減弱造成的血型錯(cuò)誤排除獲得性抗原（如類B抗原）和冷凝集現(xiàn)象對(duì)紅細(xì)胞定型的干擾不規(guī)則抗體,ABO反定型的臨床意義,錯(cuò)加試劑或標(biāo)本,,,技術(shù)和操作,,受血者紅細(xì)胞或血清,ABO正反定型不一致的原因,試劑失效或污染,細(xì)胞與血清間比例不適當(dāng),溶血現(xiàn)象未能識(shí)別,,漏加試劑,結(jié)果記錄或判斷錯(cuò)誤,,血清異常紅細(xì)胞致敏近期輸血

5、疾病導(dǎo)致抗原減弱抗體減弱不規(guī)則抗體年齡近期進(jìn)行大量血漿置換治療,,RhD定型及其常見(jiàn)問(wèn)題,,1.Rh定型RhD定型，試管法最經(jīng)典，多使用微柱凝膠卡2.RhD陰性確認(rèn)IgM抗-D陰性,,三個(gè)廠家IgG抗-D進(jìn)行確認(rèn),抗人球蛋白法進(jìn)行確認(rèn)三種IgG抗-D試劑均為陰性，報(bào)RhD陰性一種或一種以上IgG抗-D試劑為陽(yáng)性，報(bào)弱D,三、不規(guī)則抗體的篩查與鑒定,,概念,（一）,,考察心得,2,,,不規(guī)則抗體鑒定,（三）,,,篩查方法

6、,（二）,,,影響因素,（四）,,,遇到的問(wèn)題,五,不規(guī)則抗體的篩選和鑒定,患者血清+試劑篩選紅細(xì)胞 鹽水介質(zhì) 聚凝胺介質(zhì)（最為常用） 抗人球蛋白介質(zhì)（最為常用敏感） 酶介質(zhì)法,,要求和內(nèi)容結(jié)果解釋及處理方案影響因素,四、交叉配血試驗(yàn),,交叉配血的主次側(cè),接收申請(qǐng)單和血標(biāo)本,核對(duì)無(wú)誤（如有錯(cuò)誤與醫(yī)生/護(hù)士聯(lián)系）,進(jìn)行交叉配血,相合結(jié)果輸入微機(jī),不相合,打印發(fā)血單,血液中心,,,,,,,,交叉配血工作流程,

7、五、試驗(yàn)結(jié)果的規(guī)范化報(bào)告,血庫(kù)收到輸血申請(qǐng)單后，進(jìn)行交叉配血試驗(yàn)申請(qǐng)單：申請(qǐng)日期、需要血液的日期和時(shí)間、患者姓名、出生日期、性別、住院號(hào)、病房號(hào)等信息齊全，并申請(qǐng)人簽字發(fā)血單：受血者姓名、性別、病案號(hào)、ABO及Rh血型、供血者編號(hào)及血型、交叉配血實(shí)驗(yàn)結(jié)果、發(fā)出血液品種及血量、發(fā)血日期及時(shí)間、配血者、發(fā)血者和取血者姓名雙方核對(duì)申請(qǐng)單、血液標(biāo)簽和血液外觀等,發(fā)血程序（常規(guī)和緊急情況）,1.常規(guī)情況下發(fā)血的一般程序 (1)臨床申請(qǐng)

8、 (2)血液新鮮程度的選擇(大量用血和新生兒) (3)血型的選擇(ABO、Rh、新生兒換血、不規(guī)則抗體篩檢) (4)交叉配血 (5)發(fā)血，做好記錄,發(fā)血程序（常規(guī)和緊急情況）,2.緊急情況下發(fā)血的一般程序 (1)快速檢血型，選ABO、Rh同型血 (2)標(biāo)記“未經(jīng)配血”字樣 (3)留供受者血樣 (4)發(fā)血后做好記錄 (5)與臨床保持聯(lián)系,第二節(jié) 鹽水介質(zhì)試驗(yàn)技術(shù),本質(zhì)凝集反應(yīng)，直接凝集試驗(yàn)檢測(cè)IgM

9、類抗體基本方法：平板法、試管法、微孔板法,結(jié)果判讀陽(yáng)性：凝集或溶血陰性：紅細(xì)胞呈游離混懸狀態(tài),第二節(jié) 鹽水介質(zhì)試驗(yàn)技術(shù),瓷板法,試管法,微孔板法,試管法結(jié)果判定,紅細(xì)胞凝集強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn),第三節(jié) 酶處理試驗(yàn)技術(shù),試驗(yàn)原理酶試驗(yàn)技術(shù)的分類結(jié)果判讀影響因素,第四節(jié) 抗球蛋白試驗(yàn)技術(shù),抗人球蛋白試驗(yàn)：又稱Coombs試驗(yàn)，是診斷自身免疫性溶血性貧血的重要依據(jù)。主要用于檢測(cè)IgG、IgA等抗體參與的抗原-抗體反應(yīng)，也可測(cè)定補(bǔ)體

10、組分C3、C4片段參與的免疫反應(yīng)分類：直接抗球蛋白試驗(yàn)和間接抗球蛋白試驗(yàn),抗球蛋白試驗(yàn)原理,Coombs利用抗球蛋白抗體作為第二抗體，連接與紅細(xì)胞表面抗原結(jié)合的特異抗體，使紅細(xì)胞凝集。直接試驗(yàn)：是檢查被檢紅細(xì)胞上有無(wú)不 完全抗體。間接試驗(yàn)：是檢查血清中游離的不完全抗體,直接Coombs試驗(yàn),,,抗人免疫球蛋白,自身抗體,間接Coombs試驗(yàn),,,抗人免疫球蛋白,,,同種異型抗體,2不完全抗體可以結(jié)合在紅細(xì)胞

11、表面,但是不能和兩個(gè)紅細(xì)胞同時(shí)結(jié)合（致敏）。,3加入抗人球蛋白,1紅細(xì)胞彼此之間有一定的間距,4抗人球蛋白可以同時(shí)和兩個(gè)不完全抗體的FC段結(jié)合，從而把紅細(xì)胞連接在一起,2.抗人球蛋白交叉配血法示意圖,直接法： 常用于新生兒溶血癥、自身免疫性溶血癥、特發(fā)性自身免疫性貧血和醫(yī)源性溶血性疾病等的檢測(cè)。 間接法： 多用于檢測(cè)母體Rh（D）抗體，以便及早發(fā)現(xiàn)和避免新生兒溶血癥的發(fā)生。亦可對(duì)紅細(xì)胞不相容的輸血所產(chǎn)生的血型抗

12、體進(jìn)行檢測(cè)。,抗球蛋白試驗(yàn)原理,結(jié)果判讀,直接抗球蛋白試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照管凝集，陰性對(duì)照管不凝集，被檢管凝集，判定為陽(yáng)性陽(yáng)性對(duì)照管凝集，陰性對(duì)照管不凝集，被檢管不凝集，需要做陰性確認(rèn)后判定結(jié)果（無(wú)凝集的被檢管中加入IgG抗-D致敏紅細(xì)胞后離心，出現(xiàn)凝集判陰性，否則重新試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照管不凝集和（或）陰性對(duì)照管凝集，結(jié)果不可信不發(fā)報(bào)告，分析原因重做,陽(yáng)性對(duì)照管呈現(xiàn)凝集反應(yīng)，陰性對(duì)照管未呈現(xiàn)凝集反應(yīng)，被檢管呈現(xiàn)凝集反應(yīng)為陽(yáng)性結(jié)果，被檢者血清內(nèi)含

13、有抗體，如果自身對(duì)照無(wú)凝集，同種抗體；如果被檢者結(jié)果陰性，被檢者血清中未被查出意外抗體。陽(yáng)性對(duì)照管不凝集和（或）陰性對(duì)照管出現(xiàn)凝集，實(shí)驗(yàn)失敗。,結(jié)果判讀,抗球蛋白試劑不純,,,假陽(yáng)性,,假陰性,紅細(xì)胞洗滌已凝集,紅細(xì)胞質(zhì)量,不抗凝標(biāo)本,,漏加試劑,離心過(guò)度,,紅細(xì)胞、血清及試劑質(zhì)量洗滌不充分操作過(guò)程不連續(xù)離心過(guò)度紅細(xì)胞過(guò)多或過(guò)少血清濃度過(guò)大孵育時(shí)間和溫度不當(dāng)前帶現(xiàn)象,間接抗球蛋白試驗(yàn),鹽水保存不當(dāng),紅細(xì)胞直抗陽(yáng)性,抗球蛋

14、白試驗(yàn)的影響因素,抗體親和力孵育時(shí)間和溫度：IgG抗體、補(bǔ)體致敏37℃，30∽60min離子強(qiáng)度抗原抗體比例洗滌體外補(bǔ)體致敏紅細(xì)胞自身凝集,,第五節(jié) 聚凝胺介質(zhì)試驗(yàn)技術(shù),聚凝胺介質(zhì)試驗(yàn)技術(shù),是一種快速、簡(jiǎn)便、紅細(xì)胞不完全抗體的方法多數(shù)IgG抗體能夠被檢出，但I(xiàn)gG抗-K抗體除外漢族至今未發(fā)現(xiàn)K抗原陽(yáng)性，也未檢出抗-K抗體,紅細(xì)胞抗原抗體反應(yīng)過(guò)程,抗原抗體的靠近： 紅細(xì)胞抗原位點(diǎn)帶負(fù)電荷，抗體Fab端帶正電（K

15、ell系統(tǒng)抗原帶正電荷）抗原抗體的結(jié)合： 靜電引力、氫鍵、疏水鍵及范德華力,影響紅細(xì)胞抗原抗體反應(yīng)的因素,離子強(qiáng)度： 反應(yīng)液中的電解質(zhì)會(huì)增加溶液的介電常數(shù)，減弱抗原抗體間的靜電作用 降低離子強(qiáng)度可以顯著增加抗原抗體結(jié)合速率。如:離子強(qiáng)度由0.17M降到0.03M時(shí)，抗D和D陽(yáng)性紅細(xì)胞的開(kāi)始結(jié)合速率增加1000倍。,紅細(xì)胞表面電荷及其相互之間的距離,１.低離子強(qiáng)度作用原理,當(dāng)溶液中缺少離子時(shí)，抗原抗體之間的靜

16、電作用力強(qiáng)當(dāng)溶液中離子增多時(shí)，抗原抗體之間的靜電作用力弱,２.低離子聚凝胺交叉配血技術(shù),原理：聚凝胺（Polybrene），一種高價(jià)陽(yáng)離子季胺鹽多聚物，溶解后能產(chǎn)生很多正電荷，可以中和紅細(xì)胞表面的負(fù)電荷，使紅細(xì)胞之間距離減少，能引起正常紅細(xì)胞可逆性的非特異性凝集。如果使抗體致敏的紅細(xì)胞被聚凝胺凝集，則凝集不可逆。,1 紅細(xì)胞間有一定間距,,2 加入聚凝胺后，可以縮短紅細(xì)胞之間的距離，使其非特異性凝集,3 加入枸櫞酸鈉，可以中和

17、聚凝胺,4 紅細(xì)胞的非特異性凝集消失,聚凝胺交叉配血技術(shù)示意圖1,,,聚凝胺,枸櫞酸鈉,1 紅細(xì)胞上已有不完全抗體致敏,2 加入聚凝胺后，縮短紅細(xì)胞之間的距離，讓不完全抗體可以同時(shí)與兩個(gè)紅細(xì)胞結(jié)合使其特異性凝集,3 加入枸櫞酸鈉中和聚凝胺,4 由于不完全抗體的結(jié)合，紅細(xì)胞的特異性凝集不消失,聚凝胺交叉配血技術(shù)示意圖2,,,,聚凝胺,枸櫞酸鈉,不完全抗體,注意事項(xiàng),不能使用含枸櫞酸鈉和肝素抗凝標(biāo)本按比例加樣，非特異凝集60秒內(nèi)觀察結(jié)果

18、出現(xiàn)不配合試驗(yàn)時(shí)，抗球蛋白重復(fù)，結(jié)果不一致時(shí)以抗球蛋白試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)一般使用血清對(duì)Kell系統(tǒng)檢測(cè)不理想按照說(shuō)明書(shū),聚凝胺方法的特點(diǎn),靈敏：靈敏度高速度快：實(shí)驗(yàn)時(shí)間5分鐘左右準(zhǔn)確：準(zhǔn)確度高于酶試驗(yàn)不適合于Kell系統(tǒng)抗體的檢測(cè)，但黃種人群中Kell系統(tǒng)抗體極罕見(jiàn)操作要求較高,第六節(jié)微柱凝膠實(shí)驗(yàn)技術(shù),凝膠技術(shù)的原理,,,,凝膠技術(shù)的原理：,A、反應(yīng)室：下端底孔很小，液體在孵育過(guò)程中不會(huì)流入下方微柱中。B、試劑或鹽水層：紅細(xì)

19、胞在離心力作用下穿越該層，紅細(xì)胞與反應(yīng)室中的血清分離并與該層液體中的試劑反應(yīng)。C、粘液：親和柱中有一層粘液，作用與“試劑或鹽水層”相同。,原理：凝膠分子篩和親和效應(yīng)微柱凝膠柱中填充凝膠（葡聚糖），及相應(yīng)試劑（抗體或抗原）。凝膠分子間的間隙只允許游離紅細(xì)胞通過(guò)，分子排阻層析原則將發(fā)生凝集反應(yīng)的紅細(xì)胞阻滯于凝膠之內(nèi)，而未凝集的游離紅細(xì)胞則穿過(guò)微孔運(yùn)動(dòng)到管底，從而判定有無(wú)凝集反應(yīng)。,結(jié)果判定,新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三臨床檢驗(yàn)教研室,結(jié)果判定,簡(jiǎn)便

20、準(zhǔn)確敏感：在凝膠試驗(yàn)中常能發(fā)現(xiàn)其它試驗(yàn)不易發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題。結(jié)果可保存 凝膠試驗(yàn)的結(jié)果可在冰箱中保存數(shù)日，并且較容易被拍成照片。操作技術(shù)要求較低：凝膠試驗(yàn)的操作主要是簡(jiǎn)單的加樣和判讀，孵育、離心過(guò)程都有專門(mén)的設(shè)備。其中能被人為改變的因素較少。無(wú)需洗滌的抗人球蛋白試驗(yàn),優(yōu)點(diǎn)：,第七節(jié) 吸收放散試驗(yàn),吸收試驗(yàn)原理,待檢紅細(xì)胞,已知效價(jià)的抗A或抗B血清,,吸收液,,已知抗原的紅細(xì)胞,,,滴定,比較吸收前后血清中抗

21、體效價(jià),,紅細(xì)胞上有無(wú)相應(yīng)抗原及其強(qiáng)度,,間接判定待檢紅細(xì)胞血型及其亞型種類,熱放散試驗(yàn)原理,待檢紅細(xì)胞,分型血清,,物理?xiàng)l件的改變（加熱）,抗體,待檢紅細(xì)胞,試 劑紅細(xì)胞,,,確定抗體的種類和強(qiáng)度,,判定待檢紅細(xì)胞上抗原的型別,放散,凝集或致敏,,吸收放散試驗(yàn)應(yīng)用,證實(shí)存在于紅細(xì)胞上的弱抗原分離、鑒定混合抗體除去血清中不需要的抗體濃縮低效價(jià)抗體核實(shí)抗體特異性鑒定新生兒溶血病和免疫性輸血反應(yīng)的抗

22、體研究鑒別免疫性溶血性貧血的抗體,第八節(jié) 凝集抑制試驗(yàn),凝集抑制試驗(yàn),可溶性血型物質(zhì)：血型抗原除了存在于人體的紅細(xì)胞膜上以外，某些也以游離形式存在于血漿、尿液等液體中。ABH、P物質(zhì)等與對(duì)應(yīng)的血型抗體結(jié)合，可中和該抗體，或使該抗體凝集對(duì)應(yīng)紅細(xì)胞的能力受到抑制，成為凝集抑制試驗(yàn),凝集抑制試驗(yàn)原理,分泌型、非分泌型證明可溶性ABH或Lewis抗原存在鑒定體液和（或）非紅細(xì)胞上血型物質(zhì)時(shí)，利用這些血型物質(zhì)結(jié)合相應(yīng)抗體，再用紅細(xì)胞抗