免疫細胞的檢測

1、免疫學檢測與免疫學技術,一、抗原抗體的檢測技術二、免疫細胞的檢測三、細胞因子的檢測四、免疫相關基因分析五、免疫標記技術六、免疫PCR(IM-PCR)技術 七、雜交瘤技術與T細胞克隆技術八、新型抗體的制備技術九、抗原的制備技術,一、概述 免疫學檢測是應用免疫學理論設計的一系列測定抗原、抗體、免疫細胞及其分泌的細胞因子的實驗手段及分子生物學技術在免疫學研究中的應用。   免疫學技術

2、的應用極為廣泛,疾病的診斷、療效評價及理論研究等。 二、抗原抗體的檢測技術 *根據(jù)反應的基本原理與表現(xiàn)主要分為凝集反應、沉淀反應和補體參與的各種反應 *根據(jù)抗原抗體反應設計的試驗還有標記抗原(或抗體)檢測相應物質的標記技術。,對機體參與免疫應答的細胞進行鑒定,計數(shù)及功能測定 (一)細胞計數(shù)1. 熒光抗體染色2. 免疫酶染色技術: *ABC法 *APAAP法3. 免疫金銀染色法(IGSS)4．免疫細胞

3、化學法5．四聚體法6．TCR?鏈測定,三、免疫細胞的檢測,(二)免疫細胞功能的測定 1. T細胞功能測定：腫瘤，病毒感染，免疫缺陷，自身免疫病等 (1)細胞增殖(轉化)試驗：可分為非特異性絲裂原和特異性抗原兩類。 *絲裂原主要有PHA、Con A和PWM； *抗原刺激物有破傷風類毒素、PPD和白色念珠菌等； *同種MHC及抗CD3單抗等 *腫

4、瘤細胞-自體淋巴細胞混合培養(yǎng) (2)T細胞介導的細胞毒試驗：CTL (3)分泌功能檢測 (4)T細胞功能的體內(nèi)檢測法 *接觸性超敏反應*移植物抗宿主反應(GVHR) *遲發(fā)型超敏反應(DTH),2. B細胞功能判定(1)B細胞增殖(轉化)試驗：*PWM、SAC，LPS（對小鼠B細胞）；*抗IgM抗體及EB病毒等(2)溶血空斑形成試驗(3)反向溶血空斑試驗(4)酶

5、聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT):ELISPOT是一種可檢測抗體分泌細胞，又可測定抗體分泌量的體外實驗方法。*此法的主要優(yōu)點是:① 穩(wěn)定、特異，且抗原用量少；②可同時檢測不同抗原誘導的抗體分泌，并可定量測定；③可檢測組織切片中分泌抗體的單個細胞。,3. NK細胞活性測定 體外檢測NK細胞活性的方法有形態(tài)學檢查法，放射性核素釋放法，酶釋放法，化學發(fā)光法及流式細胞術等。測定人NK細胞活性常以K562細胞株作為

6、靶細胞，測定小鼠NK細胞活性常用YAC－1 細胞為靶細胞。 (1)形態(tài)學檢查法 (2)放射性核素釋放法：用放射性核素(51Cr、125I －UdR)標記靶細胞。 (3)酶釋放法：測定靶細胞膜受損后從胞漿內(nèi)釋放至介質中的乳酸脫氫酶(LDH)活性。*NAG酶熒光比色法:NAG酶是細胞漿中存在的一種溶酶體酶,與其底物作用后,生成熒光產(chǎn)物,應用熒光分光光度計測定，敏感性明顯高于LDH比色法。而且方法簡單，結果穩(wěn)定，重復

7、性好。,(4)化學發(fā)光法(5)流式細胞術：應用FCM檢測NK細胞活性是根據(jù)PI染料排斥法。PI滲入死亡細胞內(nèi)與DNA和RNA結合，在488nm波長激發(fā)下產(chǎn)生綠色熒光。此法既可以測定單個細胞毒活性，也可以用于總細胞毒活性試驗。*還可利用熒光染料法,細胞光掃描法，雙標記細胞毒法測定細胞毒性細胞的殺傷效應。,4．吞噬細胞功能測定(1)中性粒細胞趨化功能測定：一般采用濾膜滲透法(Boyden小室法)或瓊脂糖平板法。(2)中性粒細胞吞噬、

8、殺菌功能測定1)顯微鏡檢法2)NBT試驗：此項試驗是測定中性粒細胞吞噬、殺菌功能的一種簡易方法。3)化學發(fā)光測定法：中性粒細胞在吞噬過程中出現(xiàn)呼吸爆發(fā),產(chǎn)生活性氧代謝產(chǎn)物。此類活性氧化基團與細胞內(nèi)殺菌作用密切相關，同時又能激發(fā)細胞內(nèi)某些物質產(chǎn)生化學發(fā)光。,(4)巨噬細胞細胞毒測定:通常取小鼠腹腔巨噬細胞，以?-干擾素為激活劑使其活化，作為效應細胞。用125I-UdR標記的DBA/2小鼠肥大細胞瘤P815作為靶細胞。(3)巨噬細胞

9、吞噬功能測定：中藥斑蝥酒精浸液敷貼法誘發(fā)無菌性皮炎，從皮膚水泡滲出液中收集巨噬細胞，在體外進行雞紅細胞吞噬試驗，計算吞噬率和吞噬指數(shù)，作為判斷巨噬細胞吞噬功能的指標。,四、細胞因子的檢測,（一）免疫學檢測法 免疫學檢測的基本原理是將細胞因子作為抗原進行定量檢測。如免疫斑點法、ELISA法、RIA法和免疫印跡法等均已用于細胞因子的檢測。某些細胞因子含量甚微的樣品(如腦脊液)可用免疫聚合酶鏈反應(immuno-PCR)進行

10、檢測。,（二）生物學測定法 根據(jù)細胞因子對特定的生物學活性,應用相應的指示系統(tǒng),同時與標準品對比測定,從而得知樣品中細胞因子的活性水平,一般以活性單位(U/ml)表示。 靶細胞可直接從組織中分離,如骨髓細胞的集落形成試驗和胸腺細胞(脾細胞)的增殖試驗,或用體外培養(yǎng)的依賴細胞因子才能生長的細胞因子依賴株及對細胞因子殺傷敏感的細胞作為靶細胞。,1. 促進細胞增殖和增殖抑制法 *多種IL、表皮生長因子、轉化

11、生長因子α、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、成纖維細胞生長因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子 *各種CSF作用于造血系統(tǒng)的不同細胞,可促進其增殖及在半固體瓊脂凝膠系統(tǒng)中克隆培養(yǎng)骨髓細胞的集落形成,故可采用集落形成試驗研究CSF的水平 *常用的檢測細胞增殖的方法有3H-TdR摻入法、比色法、染色法和直接計數(shù)法等。其中測定細胞代謝酶反應細胞增殖數(shù)的比色法包括 MTT、XTT、MTS和NAG等方法。,2. 細胞毒活性

12、測定法 許多細胞因子(TNF)針對轉化的細胞及病毒感染的細胞具有溶細胞或抑制細胞生長的活性。,3.抗病毒活性測定法 常用于檢測抗病毒活性的細胞株有WISH,Hep2/c,L929,A549和MDBK等。其中WISH和Hep2/c細胞株用以檢測人干擾素,L929細胞株用于檢測小鼠干擾素,Ratec細胞株用于檢測大鼠干擾素,而MDBK細胞株則可用于檢測多種族的IFN-α和IFN-γ。

13、 常用于攻擊細胞的病毒有濾泡性口炎病毒(VSV)、鼠腦心肌炎病毒(EMCV)以及Sindbis virus等病毒。 檢測抗病毒活性的方法:測定細胞因子抑制病毒的致細胞病變效應(CPE)、抑制病毒蝕斑形成或抑制病毒的產(chǎn)量等。,4.趨化活性測定法 多種細胞因子具有趨化活性，分別能誘導中性粒細胞、單核/巨噬細胞和淋巴細胞定向遷移 趨化因子誘導細胞移動的方式包括趨化性和化學增活現(xiàn)象。

14、 趨化性(chemotaxis)是指誘導細胞向趨化因子化學濃度高的方向作定向移動,可采用瓊脂糖和微孔小室趨化試驗測定細胞因子的趨化活性； 化學增活現(xiàn)象(chemokinesis)是指增強細胞的隨機運動,可采用瓊脂糖小滴化學動力學試驗檢測。,(三)分子生物學測定法 RNA印跡法、核酸酶保護分析、原位雜交、PCR和Real Time PCR等。亦可通過檢測細胞內(nèi)細胞因子的基因組成或mRNA量，推算出

15、細胞因子的合成量。,(四)單個細胞產(chǎn)生細胞因子測定法 常用的方法有反向溶血空斑試驗(RHPA)和反向ELISA斑點試驗 (1)反向溶血空斑試驗(RHPA):RHPA是一種體外檢測抗體分泌細胞的試驗,亦可用于檢測細胞因子。 (2)酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT):所用的包被抗體與酶標抗體應分別針對細胞因子的不同抗原決定簇,(五)細胞內(nèi)細胞因子的檢測 采用FCM免疫熒光技術可從單細胞水平檢測

16、不同細胞亞群中的細胞因子,用兩種標記的熒光抗體可在一種細胞內(nèi)同時測定兩種不同的細胞因子。,細胞因子受體檢測的基本技術,細胞因子的廣泛生物學活性是通過與各自相應的受體結合而發(fā)揮的。因此細胞因子受體的檢測與細胞因子檢測一樣，已成為基礎理論和臨床免疫學研究的一個重要內(nèi)容。,五、粘附分子的檢測,某些粘附分子除表達于細胞膜表面外，還以可溶性形式存在于體液中。粘附分子的檢測方法目前大多采用免疫學技術檢查其在細胞膜上的分布和測定某些樣品中的含量。,六

17、、免疫相關基因分析,*包括各種類型的雜交技術，如轉印雜交、斑點雜交、原位雜交等以及PCR技術等。雜交技術主要工具是核酸探針，它是指一段用放射性核素或其他標記物(生物素、熒光素、地高辛等)標記，并與目的基因互補的DNA片段或單鏈DNA、RNA。分為cDNA探針、寡核苷酸探針、基因組DNA探針及RNA探針等。*核酸探針技術的操作主要包括：①質粒DNA的提取；②靶DNA片段的分離；③靶DNA片段的標記；④待測樣品mRNA的提??；⑤標記cD

18、NA探針與待測樣品進行雜交；⑥放射自顯影或顯色分析。,(一)細胞因子基因組DNA或mRNA的檢測 1. Northern雜交分析 2. 斑點雜交法 3. 原位雜交法 4. PCR擴增產(chǎn)物雜交分析 是將細胞因子的mRNA經(jīng)過逆轉錄為cDNA，用特異性細胞因子引物進行PCR擴增，通過Southern blot后，再用標記探針檢測特異細胞因子DNA的水平。

19、5．Southern印跡雜交 6. 斑點及狹縫印跡雜交: 將DNA變性后直接點樣于硝酸纖維膜上再進行雜交 7. 細胞因子mRNA表達的測定還可采用RT-PCR、原位雜交與原位PCR,RNA半壽期的檢測,進行中的轉錄分析等。,(二)BCR及TCR克隆性基因重排分析 1．Southern印跡雜交法：僅適用于科研，而不適用于臨床診斷。 2. PCR擴增技術:正常多克隆淋巴

20、細胞群DNA的擴增產(chǎn)物含有不同長度的片段，電泳檢查呈現(xiàn)彌漫涂片狀結構或多條帶。而單克隆性基因重排經(jīng)PCR擴增后，產(chǎn)生明顯相同長度的片段，電泳呈現(xiàn)單一緊密折帶狀結構 *應用PCR 擴增技術進行基因診斷具有特異、敏感(1/104~1/105克隆性細胞)、快速(24h可完成)等優(yōu)點。 *用于惡性淋巴瘤和白血病等的臨床診斷以及白血病治療后微小殘留病灶的檢測。,(三)HLA基因分型技術 1．序列特異性寡核苷酸

21、探針PCR(PCR-SSOP)或PCR-ASO:PCR-SSOP是目前應用最多的一種簡單、快速而又精確的HLA-Ⅱ類抗原分型方法，能鑒定所有已知序列的HLA-DR、DQ、DP等位基因，精確地分析DNA的多態(tài)性。 2．限制性片段長度多態(tài)性 (PCR-RFLP)技術：此項技術特別適用于個別標本和小樣本的檢測。 3．單鏈構象多態(tài)性PCR（PCR-SSCP）：藉此可鑒別編碼HLA-Ⅱ類抗原基因的多態(tài)性。 應用PCR-SS

22、CP可以直接比較供、受體之間HLA-Ⅱ類基因是否完全一致，且可精確到1?2個堿基之差，具有相對簡捷而精確的特點。在異基因骨髓移植的配型中已初步應用于臨床。,4．序列特異性引物PCR技術(PCR-SSP)：該法操作簡單、快速、實驗結果容易判斷，雜合子也很易檢出。不足之處在于，為檢出所有的等位基因必須用多個引物進行擴增。 5．指紋圖譜 (PCR-fingerprinting)技術|：進行HLA-基因分型鑒定時，將供、受體的DNA擴增

23、產(chǎn)物混合，電泳后得出一指紋圖，再與二者各自的PCR指紋圖譜進行比較，從中選擇出指紋圖一致的供、受體進行移植。*PCR指紋圖譜在選擇非親緣關系的供、受體進行骨髓和器官移植配型時，可以節(jié)省大量時間。6. SNP(單個核苷酸多態(tài)性)分析 (四)補體基因分析 (五)抗體基因分析 (六)細胞膜分子基因分析,七、免疫標記技術,(一)免疫熒光技術 (二)放射免疫分析法 (三)酶免疫技術 (

24、四)發(fā)光免疫測定,八、免疫PCR(IM-PCR)技術,免疫PCR是將抗原抗體的特異性反應與PCR技術結合起來,用以檢測微量蛋白質的方法。免疫PCR是用DNA分子標記特異性抗體，利用PCR可大量擴增DNA片段的特點，從而將檢測靈敏度大大提高，最低檢測值可達10-21mol/L。 1. 直接免疫PCR 是將抗原包被在固相載體上,用特異性單抗結合此抗原,再用生物素化抗體通過親合素連接生物素化DNA,然后將后者進行PCR

25、 2. 間接免疫PCR 系將所測物的單抗包被在固相載體上,然后使所測抗原與之結合,再將特異性抗體生物素化,并通過親合素連結生物素化DNA分子而將后者進行PCR,九、新型抗體的制備技術,(一)對鼠源性抗體的改造 1．人-鼠嵌合抗體(chimeric antibody)：鼠源性單抗的V區(qū)，人免疫球蛋白的C區(qū)。,2．人源化抗體 將鼠抗體的互補決定區(qū)(CDR)與人IgFR和C連接構建“人源化抗體”。 (1)

26、模板替換:使用與鼠對應部分有較大同源性的人FR替換鼠FR區(qū),例如可通過CDR移植構建“改型抗體” (2)表面重塑:對鼠CDR及FR表面殘基進行重塑或鑲飾,使之類似于人抗體CDR的輪廓或人FR的型式。 (3)補償變換:在人FR選擇與CDR有互補作用、與抗體的親和力有密切關系或對FR空間結構折疊起關鍵作用的殘基進行改變,以補償完全的CDR移植 (4)定位保留:通過計算機模建從現(xiàn)有的人源抗體保守序列

27、中搜尋與鼠FR區(qū)最類似的序列,根據(jù)最簡位置模板確定鼠可變區(qū)的關鍵位置殘基,并保留所有這些位置而將其余部分進行人源化。,3.小分子抗體 (1)ScFv：由VH和VL中間連以14?15個小肽,常用的連接肽為(Gly4Ser)3 (2)VH與VL適當部位各引入一個半胱氨酸形成以二硫鍵固定的Fv段而構成的DsFv(3)將ScFv中兩個可變區(qū)之間的接頭縮短,使兩分子間VH和VL配對形成雙價小分子抗體(Diabody) (

28、4)將兩種不同特異性的V基因交叉配對,則可得到雙特異性Diabody(5)在ScFv的一端加上一個雙聚化結構亦可構建不同類型的雙價或雙特異性小分子抗體,如Minibody等,(二)抗體庫技術 (三)產(chǎn)生嵌合抗體的小鼠和產(chǎn)生人抗體的小鼠 利用基因打靶和取代的方法以及轉基因技術產(chǎn)生嵌合抗體。 通過轉基因、基因缺失及雜交和選擇等一系列過程，獲得雙轉染基因(人H、?鏈基因)的純合小鼠。其脾、淋巴結、骨髓中的

29、B細胞可表達人的??鏈。,(四)細胞內(nèi)抗體*細胞內(nèi)抗體是指在細胞內(nèi)合成并作用于細胞內(nèi)組分的抗體,亦稱為內(nèi)抗體(intrabody)。*若在抗體基因的N端或C端加入引導序列就能使抗體表達定位亞細胞部位,如胞漿、線粒體、內(nèi)質網(wǎng)或細胞核部位。*若在細胞內(nèi)表達特異識別與腫瘤發(fā)生有關的癌基因編碼的抗體,即可抑制癌基因編碼產(chǎn)物的表達,可用于腫瘤的治療。*細胞內(nèi)免疫用于病毒性疾病的治療*抗EGFR胞外區(qū)的ScFv-R IR,并在ScFv-R

30、 IR的C-末端連接KDEL肽,提供ER滯留,(五)基因工程抗體衍生技術 1．雙特異性抗體(BsAb)或稱雙功能抗體(BfA)。 2. 抗體的抗原化技術：借助人源化抗體的構建方法，以抗體V區(qū)作為分子載體來表達生物學相關的多肽或外源性抗原表位，即抗原化抗體(antigenized antibody,AbAg)。 3．抗體重組免疫毒素 4.催化抗體(catalytic anti

31、body)或抗體酶(abzyme)：將催化活性引入抗體的結合部位,產(chǎn)生一種具有抗體和酶雙功能的蛋白質,稱為抗體酶或程序性酶(programmable enzyme)。,十、雜交瘤技術與T細胞克隆技術,一、雜交瘤技術 1. B細胞雜交瘤技術與單抗的制備 2. T細胞雜交瘤技術與其功能的研究二、 T細胞克隆技術 *按其特異性分為抗原特異性和非特異性T細胞克隆。 *按其功能則可分為輔助性和細胞毒性T細胞克隆。

32、 (一)抗原特異性T細胞克隆 (二)抗原非特異性T細胞克隆的制備 (三)同種反應性TH和CTL克隆的制備 (四)腫瘤抗原特異性CTL克隆,細胞凋亡的檢測,一、概述細胞凋亡(apoptosis,Apo)是生物體內(nèi)無用的、老化的一些損傷細胞自動死亡的一種形式，是指在一定的生理和病理情況下,機體為維護內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,通過基因調控而使細胞自動消亡的過程。,二、細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別*細胞壞死是細胞膜,線粒體膜

33、結構、流動性、滲透性及受體等均受損, 進而細胞溶解、壞死；而細胞凋亡時上述結構和功能均保持不變；*細胞壞死時,ATP和蛋白質合成抑制及終止;細胞凋亡時,ATP、mRNA和蛋白質合成依舊,細胞第二信號系統(tǒng)仍活動;*細胞壞死時,細胞DNA隨機降解,電泳不呈梯狀圖譜;細胞凋亡時,DNA多降解成180～200bp或其倍數(shù)的梯狀片段,電泳呈梯狀圖譜;*細胞壞死時,細胞內(nèi)容物外溢,引起局部炎癥反應或組織損傷;細胞凋亡時,細胞內(nèi)容物不外溢, 所

34、以不引起炎癥反應或局部損傷;*細胞壞死時,往往是成團細胞死亡;細胞凋亡時,在組織中呈分散狀態(tài)分布。,三、研究細胞凋亡的意義1. 細胞凋亡在腫瘤形成和治療中具有重要作用。*凋亡基因與抗凋亡基因突變 →→易形成腫瘤；*免疫效應細胞表達FasL, 腫瘤細胞表達Fas→→誘導腫瘤細胞凋亡 →→抗腫瘤*腫瘤細胞高表達FasL→→誘導免疫細胞凋亡 →→抑制免疫功能→→逃避免疫

35、監(jiān)視*腫瘤細胞低表達或不表達Fas →→逃避免疫監(jiān)視,2. 細胞凋亡與免疫學的關系*細胞凋亡與T細胞在胸腺的發(fā)育*細胞凋亡與成熟T細胞：AICD*細胞凋亡與與B細胞*細胞凋亡與胞毒效應3.細胞凋亡參與自身免疫病的發(fā)生4.細胞凋亡與病毒感染*抗病毒免疫防御*細胞凋亡與AIDS*細胞凋亡與病毒性肝炎,細胞凋亡的檢測方法,一、形態(tài)學方法 1．普通光學顯微鏡檢測法 2．熒光顯微鏡檢測法

36、 材料：①石蠟切片;②冰凍切片;③細胞學涂片。 方法一：①PI染液：碘化丙啶(propidium iodide,PI)；②DAPI染液；③AO染液： *熒光顯微鏡下觀察。PI染色選用>600nm的激發(fā)光,DAPI選用460～500nm的激發(fā)光,AO染色選用520nm的激發(fā)光。 *HE染色核DNA呈藍色,而PI染色呈紅色,DAPI染色呈藍白色,AO染色呈黃綠色。凋亡細胞呈現(xiàn)核濃縮,染色加深,或核染色質呈新月

37、形聚集于核膜一邊;晚期凋亡細胞表現(xiàn)為核碎裂成大小不等的圓形小體被細胞膜包繞,即凋亡小體。,方法二：Hoechst 33342/PI雙標記法 *在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細胞的藍色熒光比活細胞和非凋亡細胞都要強，其光散射能力則降低，將二者結合起來，可以很好地鑒定凋亡細胞。壞死細胞則由于PI復染，呈紅色熒光。是目前細胞凋亡最滿意的形態(tài)學分析方法。 *樣品來源 培養(yǎng)細胞或離體細胞制成的單個細胞懸液。,方法三：碘化丙啶（PI）和

38、Hoechst 33342(HO)雙染法PI和HO均可使用紫外光激發(fā)，其熒光分別為紅光和藍光。對照活細胞的HO藍色熒光最強，而早期凋亡細胞由于其DNA降解和丟失，其HO藍色熒光較弱，也有很弱的PI紅色熒光。晚期凋亡細胞PI紅色熒光增強，壞死細胞PI紅色熒光最強，而HO藍色熒光較弱。,3．凋亡小體的電鏡觀察 小體系由細胞膜卷曲、脫落形成的小泡,其內(nèi)包含有完整的細胞器及核片段。,二、生物化學方法 電泳法 DNA梯帶(DNA

39、 ladder)。,三、免疫學方法(ELISA法)*細胞凋亡的發(fā)生,是由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活,核小體間區(qū)雙鏈DNA解開,產(chǎn)生單/低聚核小體片段,而核小體DNA由于與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密復合物而不被核酸內(nèi)切酶裂解。采用雙抗體夾心酶免疫法,應用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體,與核小體片段形成夾心結構,可特異性檢測細胞溶解物中的單/低聚核小體。,四、原位末端轉移酶標記技術 (TdT或TUNEL)

40、 凋亡細胞由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活,核DNA被切割成許多雙鏈DNA片段以及高分子量DNA單鏈斷裂點(缺口),暴露出大量3'羥基末端,如用(TdT)將標記的-dUTP進行缺口末端標記,則可原位特異地顯示出凋亡細胞。 (一)熒光標記法 *采用美國Oncor公司ApopTag TM 試劑盒，或德國Boehringer Mannheim公司In Situ Cell Death Detection試劑盒 (二