犬細胞免疫因子RT-qPCR檢測方法的建立及應用.pdf

1、實時熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光探針或者熒光染料，利用熒光信號的積累，實時監(jiān)測整個PCR的反應進程，通過制作出的標準曲線，對未知模版進行定量分析。因其具有操作簡便、快速高效、高敏感性等特點，被廣泛應用于分子診斷、分子生物研究、動物及食品安全檢測等方面。
　　本實驗分離了犬全血中的外周血淋巴細胞，通過PCR成功擴增出IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α等幾種細胞免疫因子的基因片段，連接pMD-18T載體，轉

2、化到DH5α感受態(tài)細胞中，在Amp抗性培養(yǎng)基上進行篩選、PCR和測序等驗證，構建了標準品質粒。最后成功建立了檢測犬全血中IL-4、1L-10、IL-13、IFN-α等細胞因子的實時熒光定量PCR的方法，該方法的模版在102～108拷貝/μL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)R2均達到0.992以上。利用該方法對犬瘟熱病毒(CDV)、犬細小病毒(CPV)、犬腺病毒Ⅰ型(CAV-1)三聯(lián)活疫苗免疫比格犬后的細胞免疫水平進行了評價。