檢測(cè)CTV的實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR技術(shù)研發(fā)與應(yīng)用.pdf

1、柑橘衰退病是由柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)引起的一種具有經(jīng)濟(jì)重要性的柑橘病毒病害，廣泛分布于世界各柑橘產(chǎn)區(qū)。我國是柑橘生產(chǎn)大國，種植面積居世界第一，產(chǎn)量居世界第二。隨著20世紀(jì)80年代后期我國進(jìn)行柑橘產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，加大了柚類和甜橙的種植比例，CTV莖陷點(diǎn)型毒株對(duì)柚類和某些甜橙的危害變得日益嚴(yán)重。國外的防治經(jīng)驗(yàn)表明，在CTV強(qiáng)毒株和強(qiáng)傳媒橘蚜并存的地區(qū)，弱毒株的交叉保護(hù)(MSCP，Mild Strai

2、n Cross Protection)是最有效的防治方法。建立一種快速、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)CTV的方法不僅對(duì)預(yù)測(cè)CTV的發(fā)生和流行具有現(xiàn)實(shí)意義，而且對(duì)田間不同CTV株系侵染力的鑒定具有指導(dǎo)意義，同時(shí)運(yùn)用該方法有助于對(duì)MSCP防治機(jī)理的深入研究。 本研究基于CTV基因組同源性較高的3’端設(shè)計(jì)篩選引物，運(yùn)用SYBR Green Ⅰ熒光染料法建立一種檢測(cè)CTV的實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR(Reverse Transcfiption and q

3、uantitative PolymeraseChain Reaction)體系，并應(yīng)用于檢測(cè)田間不同致病力的CTV株系。同時(shí)運(yùn)用該方法建立了針對(duì)CTV強(qiáng)毒株CT11和弱毒株CT11的MSCP防效檢測(cè)體系，對(duì)25頭和50頭蚜蟲接種強(qiáng)毒分離株后的拮抗效果進(jìn)行研究。主要研究結(jié)果如下： 1.在國內(nèi)首次建立了檢測(cè)CTV的實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR體系，該體系具有污染幾率小(全封閉體系反應(yīng))、快速(整個(gè)過程只需要2.5h)、操作和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、

4、成本較低等優(yōu)點(diǎn)。 2.該體系特異性強(qiáng)(對(duì)碎葉病、溫州蜜柑萎縮病和鱗皮病無特異性擴(kuò)增)，線性范圍寬(8×102～8×108拷貝/μL，r2=1.000)，靈敏性高(最低檢測(cè)限為8×100貝/μL，比常規(guī)PCR靈敏100倍)，重復(fù)性好(批內(nèi)CV值1.6％，批間CV值3.2％)，是CTV定量分析的有效手段。 3.運(yùn)用該體系對(duì)田間樣品的檢測(cè)結(jié)果表明該體系能穩(wěn)定檢測(cè)到田間受不同致病力感染的CTV株系，對(duì)田間的攻毒檢測(cè)有指導(dǎo)意義。

5、 4.根據(jù)CTV全基因組的T3K17區(qū)域設(shè)計(jì)篩選出一對(duì)引物(TQ1和TQ2)米區(qū)分CTV強(qiáng)毒株CT14和弱毒株CT11，同時(shí)篩選了2對(duì)參考基岡ACT2和18SrRNA作為相對(duì)定量表達(dá)分析的內(nèi)參，分別建立了3個(gè)基岡各自的普通PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR檢測(cè)體系，前者能穩(wěn)定擴(kuò)增出目的基因；后者能準(zhǔn)確可靠的對(duì)目的基因進(jìn)行定量。 5.首次運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR技術(shù)對(duì)免疫接種了弱毒株的植株拮抗接種后CTV強(qiáng)毒株的時(shí)空分布進(jìn)行