07、微生物遺傳

1、微生物的遺傳變異和育種,第 七 章,,,,,遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)基因突變和誘變育種基因重組和雜交育種基因工程菌種的衰退復(fù)壯和保藏,,一、三個經(jīng)典實驗,轉(zhuǎn)化實驗,噬菌體感染實驗,植物病毒的重建實驗,,第一節(jié) 遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ),證明核酸是微生物遺傳物質(zhì),,,,,,,1、轉(zhuǎn)化實驗,有 莢 膜、菌 落 光 滑分 泌 毒 素、致 病,無 莢 膜、菌 落 粗 糙無 毒、不 致 病,SⅠ SⅡ SⅢ

2、 三 個 血 清 型,RⅠ RⅡ RⅢ 三 個 血 清 型,1928年，[英] F.Griffith 首先發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。實驗材料： 肺炎鏈球菌,方法,,動物實驗,細(xì)菌培養(yǎng)實驗,S型菌無細(xì)胞抽提液試驗,,,,,,,,轉(zhuǎn)化實驗（1）,：動物實驗,,ＳⅢ〖?xì)⑺馈?無菌落生長,ＲⅡ〖活菌〗,ＲⅡ菌落,ＲⅡ菌落（多）ＳⅢ菌落（少）,ＳⅢ〖?xì)⑺馈?ＲⅡ〖活菌〗,轉(zhuǎn)化實驗（2）,：細(xì)菌培養(yǎng)實驗,,,活R菌,S菌無細(xì)胞抽提液,+,轉(zhuǎn)化實驗（3

3、）,：S型菌無細(xì)胞抽提液試驗,大量R菌落和少量S菌落,1944年，O . T . Avery等人將S菌的糖類、脂類、蛋白質(zhì)、核酸等提純后分別與R活菌混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗，結(jié)果：,結(jié)論：轉(zhuǎn)化因子是DNA， DNA 是細(xì)菌遺傳信息的載體。,,,,步驟,2、噬菌體感染實驗,1952年，A. D . Hershey和M. Chase，同位素標(biāo)記。,結(jié)論：噬菌體侵入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的僅僅是DNA,蛋白質(zhì)外殼留在細(xì)胞外；而子代噬菌體既有噬菌體DNA,又有噬菌

4、體蛋白質(zhì)外殼，證明DNA是噬菌體遺傳信息的載體。,用35S-蛋白質(zhì)標(biāo)記的噬菌體感染細(xì)菌： 放射性（蛋白質(zhì)外殼）主要在無細(xì)胞上清液中。用32P-DNA標(biāo)記的噬菌體感染細(xì)菌： 放射性(噬菌體DNA)主要在沉淀物中(細(xì)菌細(xì)胞內(nèi))。,,,結(jié)果,,,,步驟：,,3、植物病毒的重建實驗,1956年，H. Fraenkel - Conrat利用含RNA的TMV進(jìn)行植物病毒的重建實驗。,方法,結(jié)論：證明RNA是RNA

5、病毒遺傳信息的載體。,,遺傳物質(zhì)存在部位,,核染色體,核外染色體,,真核生物細(xì)胞器,原核生物質(zhì)粒,二、遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式,（一）遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)存在的七個水平：自學(xué),1、細(xì)胞水平 2、細(xì)胞核水平3、染色體水平 4、核酸水平5、基因水平 6、密碼字水平7、核苷酸水平,P192～197,,,,,,（二）原核生物的質(zhì)粒（典型的質(zhì)粒）,1、質(zhì)粒：P197,2、特點：P197~

6、198,1）質(zhì)粒是核基因組外的小型cccDNA，少數(shù)成線狀。,2）質(zhì)粒攜帶某些特殊功能基因，但對細(xì)胞的生存并非必需。,3）質(zhì)粒具有獨立復(fù)制能力。,,嚴(yán)緊型復(fù)制控制：P197松弛型復(fù)制控制：P197,4）某些理化因子能引起質(zhì)粒消除。,5）F因子、R因子等某些質(zhì)粒能在不同菌株間發(fā)生轉(zhuǎn)移。,6） F因子等某些質(zhì)粒是附加體。 附加體：P197 整合：P197,7）某些質(zhì)粒具有基因重組功能。,,,3、質(zhì)粒在基因工程中的應(yīng)用,作為

7、目的基因的克隆載體。如：E.coli的pBR322質(zhì)粒。,4、典型質(zhì)粒簡介,F質(zhì)粒（F因子）：存在于E.coli等多種細(xì)菌。決定性別，與細(xì)菌接合有關(guān)。,R質(zhì)粒（R因子，抗藥性質(zhì)粒）：存在于志賀氏菌等多種腸道菌中，與抗藥性（磺胺、抗生素等）有關(guān)。,Col質(zhì)粒（大腸桿菌素質(zhì)粒）：存在于E.coli的某些毒株中，產(chǎn)大腸桿菌素（一種細(xì)菌毒素）。,Ti質(zhì)粒（誘癌質(zhì)粒）：存在于根癌土壤桿菌中，誘發(fā)雙子葉植物細(xì)胞發(fā)生癌變。廣泛用于植物基因工程中。,降

8、解性質(zhì)粒：存在于假單胞菌屬細(xì)菌，是一類降解特殊有機(jī)物（樟腦、二甲苯等）的質(zhì)?？偡Q。如：CAM（樟腦）質(zhì)粒、OCT（辛烷）質(zhì)粒、XYL（二甲苯）質(zhì)粒等。,,,：P199~201,★ “超級菌”：通過遺傳工程手段構(gòu)建的具有數(shù)種降解性質(zhì)粒的工程菌。,一、基因突變：P202,第二節(jié) 基因突變和誘變育種,野生型：從自然界分離到的未發(fā)生突變的菌株。,,,原養(yǎng)型：突變體回復(fù)突變成野生型性狀的菌株。,突變體：發(fā)生基因突變后的微生物菌株。,(突變型、突

9、變株),(一)微生物突變體的主要類型,：P202～203,1、營養(yǎng)缺陷型 如：E.coli Trp-。,選擇性突變株,,非選擇性突變株,4、形態(tài)突變型,5、抗原突變型,6、產(chǎn)量突變型 正變株 負(fù)變株,,如:色素突變株、無莢膜突變株。,選擇性突變株：能在選擇性培養(yǎng)基上加以鑒別的突變株。,3、條件致死突變型 如：E.coli Ts突變株。,2、抗性突變型 如：E.coli str R。,,,（三）基因突變的特點：P203~2

10、04,1、自發(fā)性 2、不對應(yīng)性3、稀有性 4、獨立性5、可誘變性 6、穩(wěn)定性7、可逆性,（二）突變率,：P203。,,（四）基因突變自發(fā)性和不對應(yīng)性的證明,變量試驗、 涂布試驗、 影印培養(yǎng)試驗,,,,,,,,,,變量試驗,（1943年，Luria和Delbruck）,,,涂布試驗,（1949年，Newcombe）,,影印培養(yǎng)試驗,（1952

11、年，Lederberg等）,,（五）基因突變及其誘變機(jī)制,,自發(fā)突變,基因突變,誘發(fā)突變,突變都是自發(fā)的，某些理化因素不能改變突變方向，但可顯著提高突變頻率。,無論自發(fā)突變還是誘變，從分子水平看，都是DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的結(jié)果，機(jī)制相同。,誘變劑：能顯著提高突變頻率的各種理化因素。,,,二、突變與育種,（一）自發(fā)突變與育種,,突變是不定向的，但通過定向培育可獲得特定的變異菌株。,從生產(chǎn)中選育：從低頻率的自發(fā)突變中選育可能出現(xiàn)的正突變株

12、。,定向培育優(yōu)良品種：利用微生物的自發(fā)突變，采用特定的選育條件，不斷移植選育出優(yōu)良菌株。,,,（二）誘變育種,,誘變育種：利用誘變手段使微生物細(xì)胞發(fā)生變異，從中篩選出符合要求的變異菌株的方法。,,,,,1945,時間,1943,1943,1943,1947,1955,1971,1977,目前,發(fā)酵單位( 效價，u / ml ),100,250,500,～850,～850,～8000,～2萬,～5萬,5～10萬,從 青 霉 素 產(chǎn) 量 看

13、 誘 變 育 種,,,1、誘變育種的基本環(huán)節(jié),選擇出發(fā)菌株：誘變育種成敗的關(guān)鍵。誘變處理：微生物大多死亡，少數(shù)存活。篩選：分初篩和復(fù)篩。從少數(shù)存活（其中多數(shù)未變）的少數(shù)突變株中選育出極少數(shù)性狀優(yōu)良的正變株。,,,大多死亡,少數(shù)存活,存活率,,,多數(shù)未變,少數(shù)突變,突變率,,,多數(shù)負(fù)變,少數(shù)正變,正變率,,多數(shù)幅度小,,少數(shù)幅度大,高產(chǎn)率,,投產(chǎn)率,,多數(shù)不宜投產(chǎn),少數(shù)適宜投產(chǎn),,出發(fā)菌株,計算：,,誘變,,,（2）挑選優(yōu)良的

14、出發(fā)菌株,（1）選擇簡便有效的誘變劑,（3）處理單孢子（或單細(xì)胞）懸液,（4）選用最適誘變劑量,（5）利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng),（6）利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo),2、誘變育種中應(yīng)考慮的幾個原則,（7）設(shè)計高效篩選方案,,,（8）創(chuàng)造新型的篩選方法,,,,,,,,,（1）選擇簡便有效的誘變劑,1）常用誘變劑：紫外線、烷化劑、5-Bu、吖啶類染料等,,,2）“三致”物質(zhì),“三致”物質(zhì)：對生物具有致突變、致畸變、致癌變的化學(xué)物質(zhì)。,

15、艾姆斯試驗法（Ames test）：P215。,利用鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium，S.t.)組氨酸營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變檢測致癌劑。,A、原理：,S.t.his-,,在基本培養(yǎng)基（M M 或 [-] ）上培養(yǎng),不生長,S.t.his-,,致癌物,生長,菌株發(fā)生回變,S.t.his+,在 [-] 上培養(yǎng),,（原養(yǎng)型）,,,,,B、方法,吸入濾紙片,保溫,鼠肝勻漿（含加氧酶等）,可 疑 “ 三 致

16、” 試 樣,平貼于含S.t.his-的基本培養(yǎng)基平板上培養(yǎng),結(jié)果：,,陽性,,,生產(chǎn)中用過的自發(fā)突變菌株,性狀優(yōu)良的菌株,已誘變過的其他變異菌株,野生型菌株,對誘變劑敏感性較高的菌株,,（2）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株,1）出發(fā)菌株：用于誘變育種的原始菌株。,2）出發(fā)菌株的選擇：憑經(jīng)驗。,可供選擇的出發(fā)菌株有：,,細(xì)菌、酵母菌：使用指數(shù)期營養(yǎng)體單細(xì)胞懸液。 但芽孢桿菌應(yīng)處理芽孢。放線

17、菌、霉菌：用單孢子懸液。孢子要稍加萌發(fā)后使用。,出發(fā)菌株應(yīng)制成均勻分散的單細(xì)胞或單孢子懸液,（3）處理單孢子（或單細(xì)胞）懸液,,處理單孢子（或單細(xì)胞）懸液的原因：,,A、使用均勻分散的懸液，有利于每個細(xì)胞（孢子）均勻接觸誘變劑。B、處理單核的單細(xì)胞（孢子），有利于減少誘變后的菌株經(jīng)傳代后出現(xiàn)不純菌落 ，導(dǎo)致性狀“衰退”。,,,誘變劑量 = 誘變劑濃度（或強(qiáng)度）×處理時間但通常用相對劑量（殺菌率）表示：,（4）選

18、用最適誘變劑量,誘變劑殺菌率=（1- ）×100%,,誘變后活細(xì)胞數(shù)誘變前活細(xì)胞數(shù),1）誘變劑量,2）劑量與細(xì)胞存活率、殺菌率、突變率的關(guān)系,,劑量：,,細(xì)胞突變率：,,,,,,,低,高,細(xì)胞存活率：,高,低,殺菌率(致死率)：,低,高,低,低,高,3）合適劑量,合適劑量：能擴(kuò)大變異幅度又能促使變異移向正變范圍的劑量,紫外燈 15 W照射距離 30 cm處理時間 10 ~ 20 秒 至 1

19、0 ~ 20 min殺菌率 70 ~ 75 % 或 30 ~ 70 %,,,UV的合適劑量,化學(xué)誘變劑的合適劑量：較復(fù)雜。 常用濃度為0.01 ~ 0.1mol/L；處理時間依殺菌率定。,兩種或多種誘變劑先后使用,同種誘變劑先后重復(fù)使用,兩種或多種誘變劑同時使用,（5）充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng),利用誘變劑復(fù)合處理，能提高誘變效果。,,（6）利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理 與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo),利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理 與

20、產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)能提高初篩效率。,產(chǎn)淀粉酶突變菌株的篩選：淀粉水解試驗。,,,,,產(chǎn)淀粉酶活性不同的菌株的菌落,,,,淀粉培養(yǎng)基,,,加碘液,,有無:生理指標(biāo) 形態(tài)指標(biāo)大小:產(chǎn)量指標(biāo) 形態(tài)指標(biāo),,,類似有：蛋白質(zhì)水解圈、氨基酸顯色圈、纖維素水解圈、抗生素抑菌圈等。,,（7）設(shè)計高效篩選方案,1）通過初篩和復(fù)篩兩個階段來篩選優(yōu)良突變株。,2）對“誘變-篩選”作多輪操作可提高誘變育種的效率。,

21、,（8）創(chuàng)造新型的篩選方法,1）優(yōu)化誘變育種的工作步驟和操作方法。,2）與遺傳工程育種相結(jié)合，與自動化、電腦化的高效篩選技術(shù)相結(jié)合。,,3、突變株的篩選方法,幾個概念：P221,相關(guān)培養(yǎng)基,,基本培養(yǎng)基（M M，[-]）,完全培養(yǎng)基（C M，[+]）,補(bǔ)充培養(yǎng)基（S M，[A]或[B]等）,三類遺傳型,,野生型 [A+B+],營養(yǎng)缺陷型 [A+B-],原養(yǎng)型 [A+B+],,,（1）產(chǎn)量突變株的篩選,,,（2）抗性

22、突變體的篩選,,,酵母菌吡哆醇高產(chǎn)突變株的篩選：梯度平板法,待凝后接種經(jīng)誘變處理的菌懸液,融化的、不含藥物的瓊脂培養(yǎng)基10ml,,,融化的、含異煙肼的瓊脂培養(yǎng)基10ml,,,待凝后放平,涂布,,培養(yǎng),,異煙肼濃度梯度,,,,低濃度藥物區(qū)：大量敏感菌菌苔,,,,高濃度藥物區(qū)：幾乎無菌落,,適宜濃度藥物區(qū)： 抗性菌落(吡哆醇高產(chǎn)突變株),,高 低,抗藥性菌株的可能特性,

23、A、誘變產(chǎn)生了抗藥性基因，能編碼分解藥物的酶B、誘變產(chǎn)生的基因使某種代謝產(chǎn)物過量合成，解除了抗代謝物（藥物）的競爭性抑制作用。,本例中，異煙肼（藥物）是吡哆醇（正常代謝物）的抗代謝物，突變菌株的抗藥性即為吡哆醇過量合成。,,1）誘變處理：與一般誘變處理相同。,2）淘汰野生型（濃縮營養(yǎng)缺陷型）,（3）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選,營養(yǎng)缺陷型突變株也是一種常用的選擇性遺傳標(biāo)記菌株。,常用方法,,抗生素法,菌絲過濾法：適用于放線菌和絲狀真菌,,青

24、霉素法：適用于細(xì)菌,制霉菌素法：適用于真菌,,,淘汰野生型的基本原理和操作方法,接種到含青霉素的MM上培養(yǎng),誘變處理的細(xì)菌,野生型：在MM上生長時細(xì)胞壁合成被抑制，導(dǎo)致死亡,營養(yǎng)缺陷型：在MM上無法生長，處于休止?fàn)顟B(tài)，不死亡,,,,接種到含制霉菌素的MM上培養(yǎng),誘變的酵母菌或霉菌孢子,野生型：在MM上生長時細(xì)胞膜被損傷破壞，導(dǎo)致死亡,營養(yǎng)缺陷型：在MM上無法生長，處于休止?fàn)顟B(tài)，不死亡,,,,接種到MM上培養(yǎng),誘變的孢子,野生型：孢

25、子能萌發(fā)形成菌絲體,營養(yǎng)缺陷型：處于休止?fàn)顟B(tài)，不形成菌絲體,,,,,,過濾，去除菌絲體,保留了缺陷型孢子,A、青霉素法：,B、制霉菌素法：,C、菌絲過濾法：,,,A、夾層培養(yǎng)法,3）檢出營養(yǎng)缺陷型,,,B、限量補(bǔ)充培養(yǎng)法,,倒入含誘變菌液的限量補(bǔ)充培養(yǎng)基,限量補(bǔ)充培養(yǎng)基：在MM中加入<0.01%的蛋白胨即可,,待凝后培養(yǎng),營養(yǎng)缺陷型（小菌落）,野生型（大菌落）,,,,,,,C、逐個檢出法,,,倒入CM,,待凝后涂布誘變過的

26、菌液，培養(yǎng),長出菌落,每個菌落逐個分別點種于MM和CM平板上培養(yǎng),,MM平板,CM平板,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,營養(yǎng)缺陷型菌落,,,在CM上生長、在MM上不長的菌落是營養(yǎng)缺陷型,,,,,10,11,12,9,8,1,7,6,5,4,3,2,10,11,12,9,8,1,7,6,5,4,3,2,,未生長,,,接種時，先點種MM平板，再點種CM平板。（為什么？）,,倒入CM,,待凝后涂布誘變過的菌液，培養(yǎng),長出菌

27、落,,MM平板,CM平板,營養(yǎng)缺陷型菌落,在CM上生長、在MM上不長的菌落是營養(yǎng)缺陷型,,,,未生長,接種時，先影印接種MM平板，再影印接種CM平板。,D、影印接種法,在MM 和CM 平板上分別影印接種，培養(yǎng),,,,,4）鑒定營養(yǎng)缺陷型,生長譜法:是指在混有供試菌的平板表面點加微量營養(yǎng)物，根據(jù)營養(yǎng)物周圍是否有菌生長來確定該供試菌的營養(yǎng)要求的一種操作方法。,鑒定營養(yǎng)缺陷型時，培養(yǎng)基使用基本培養(yǎng)基。,,,,,生長圈(b營養(yǎng)缺陷型),,a

28、、c 雙重營養(yǎng)缺陷型,,第三節(jié) 基因重組和雜交育種,基因重組：P223,,,一、原核生物的基因重組（一）轉(zhuǎn)化(transformation)1928年Griffith在肺炎鏈球菌中首先發(fā)現(xiàn),1、轉(zhuǎn)化：受體細(xì)胞直接吸收了來自供體細(xì)胞的DNA片斷并整合到基因組中，使受體細(xì)胞獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象。P224,2、轉(zhuǎn)化因子：能發(fā)生轉(zhuǎn)化的游離ＤＡＮ片斷。,3、感受態(tài)：受體細(xì)胞能接受轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。P225,受體菌只有處于感受態(tài)才能

29、接受轉(zhuǎn)化因子。,4、轉(zhuǎn)化過程,,,（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction),1952年Zinder和Ledrberg在鼠傷寒沙門氏菌中首先發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過缺陷噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞的DNA片斷轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)胞基因組中，使受體細(xì)胞獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象。P226,,,,缺陷噬菌體,完全缺陷噬菌體：包裹宿主細(xì)胞任何小片段DNA，不含自身DNA的噬菌體。,部分缺陷噬菌體：包裹宿主細(xì)胞特定小片段DNA，同時含有部分自身DNA的噬菌體

30、。,（轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體）,1、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo),（1）完全轉(zhuǎn)導(dǎo)如：由P22噬菌體為媒介對鼠傷寒沙門氏菌(S.t.)的轉(zhuǎn)導(dǎo),P226 以完全缺陷噬菌體為媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo),,,（2）流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)：P227（略）,（1）低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（L F T）：P228。,2、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo),P227,1）低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物的形成,溫和噬菌體在其裂解性周期中產(chǎn)生的、含有極少數(shù)(10 - 4~10 – 6)缺陷噬菌體的裂解物。,低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物：,如：E.coli K12（ λ ）的局限性轉(zhuǎn)

31、導(dǎo),,,以部分缺陷的溫和噬菌體為媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo),2）局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子的形成,,,（2）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（H F T）：P228（略）,正常的溫和噬菌體感染宿主發(fā)生溶源化時，噬菌體基因整合到宿主核基因組上，使宿主獲得除免疫性外的新遺傳性狀的現(xiàn)象。P229如：β-溫和噬菌體對白喉棒桿菌引起的溶源轉(zhuǎn)變使 白喉棒桿菌產(chǎn)生白喉毒素。,附：溶源轉(zhuǎn)變,溶源轉(zhuǎn)變并非轉(zhuǎn)導(dǎo)。,,,（三）接合(conjugation),1946年Ledrberg和Tatum在

32、大腸桿菌中首先發(fā)現(xiàn)F因子的接合現(xiàn)象。,,,：P229,雄性菌株（供體細(xì)胞）,雌性菌株（受體細(xì)胞）,1、大腸桿菌的四種接合型菌株,3、雄性菌株與雌性菌株的接合,（1） F+與F－的接合,,,Hfr與F-接合后，受體細(xì)胞（F-）的重組頻率很高，但轉(zhuǎn)性頻率極低。,（2） H f r與F－的接合,（3） F ?與F－的接合（性導(dǎo)、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)）,,,,第四節(jié) 基因工程：略,第五節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯與保藏,一、菌種的衰退與復(fù)壯,1、菌種衰退

33、（1）菌種衰退的原因：基因突變導(dǎo)致性狀退化。（2）菌種衰退的防止方法：P241（1～4）2、菌種復(fù)壯：P241。菌種復(fù)壯的方法：P241～242,,二、菌種保藏1、菌種保藏的目的：不污染、不變異，保持原有優(yōu)良性狀。2、菌種保藏的原理：低溫、干燥、缺氧，降低微生物代謝活性。3、菌種保藏的常用方法：P244表7-13 4、若干菌種保藏機(jī)構(gòu)（1）ATCC：美國典型菌種保藏中心（2）CCCCM：中國微生物菌種保藏委員會（3）C