微生物檢驗

1、臨床微生物檢驗與藥敏解析,南京市兒童醫(yī)院檢驗科 徐飛,主要內(nèi)容,,,一、細菌分類,,,,二、臨床微生物標本的采集方法,,基本原則1.及時采集微生物標本作病原學檢查2.在抗菌藥物使用前采集標本3.采樣時嚴格執(zhí)行無菌操作4.采樣后立即送檢5.送檢標本應注明來源和檢驗目的,,最有價值的細菌學檢測項目 血液培養(yǎng) 腦脊液培養(yǎng) 膽汁培養(yǎng) 胸腹水培養(yǎng) 關節(jié)液 其他無菌體液或分泌液,,采集血培養(yǎng)樣本的最佳時間盡可能在患者寒戰(zhàn)或

2、開始發(fā)熱時采血在患者接受抗生素治療前采血如患者已經(jīng)應用抗菌藥物進行治療，應在下一次用藥之前采血培養(yǎng),,血培養(yǎng)需要采幾瓶?成人:雙側(cè)(左側(cè)+右側(cè))雙瓶(需氧+厭氧)兒童:一般雙側(cè)(左側(cè)+右側(cè))單瓶(需氧) 。特殊患者才考慮厭氧培養(yǎng)。,,表皮葡萄球菌的臨床意義,污染菌,致病菌,？,采集1瓶無法判斷是病原菌還是污染菌。,2－3套血培養(yǎng)，有助于污染的判斷。,,關于采集血液量采血量是影響靈敏度最關鍵因素成人一份標本2個培養(yǎng)瓶（需氧＋

3、厭氧），每瓶8－10ml，共20ml；要求至少采兩份標本，即40ml。兒童一般只需采集需氧瓶，采集血量一般為1－3ml采血量不足時應優(yōu)先保證需氧瓶，因臨床90％以上的感染為需氧菌或兼性需氧菌感染,,關于咳痰標本咳痰標本應用最早且廣泛，但也是最受爭議的標本 在抗生素應用前采集痰標本;標本采集后1～2h內(nèi)必須立即進行實驗室處理深咳，采集標本過程中要有專業(yè)的醫(yī)務人員指導無痰可用3％～5％NaCl 5ml霧吸約5min導痰也可

4、用物理療法、體位引流、鼻導管抽吸等法取痰,,清潔中段尿尿液通常是無菌的或一過性有少量微生物，但是尿道內(nèi)或尿道周圍皮膚的菌群會污染尿液標本，從而可能導致錯誤的培養(yǎng)結(jié)果。盡量取早晨第一次尿液棄去開始流出的尿液，以沖刷尿道口的細菌，取能代表膀胱部位病原菌的中段尿,,,三、細菌藥敏試驗,細菌藥敏試驗,常用方法： 紙片擴散法 微量液體稀釋法 E-TEST法,紙片擴散法（Kirby-Bauer法）,操作方法 ：1.將在約56℃

5、恒溫的無菌M-H瓊脂傾注直徑為90mm的平板，其厚度 4mm。,紙片擴散法（Kirby-Bauer法）,2.無菌挑取孵育16～24h的血平板上4-5個菌落。,紙片擴散法（Kirby-Bauer法）,3.置于無菌生理鹽水中，校正其濁度于McFarland No 0.5管。,紙片擴散法（Kirby-Bauer法）,4.用無菌棉簽浸入細菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過多的菌液。棉簽在三個方向均勻抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60℃）使菌液均勻分

6、布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。,紙片擴散法（Kirby-Bauer法）,5.用無菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂的表面，一旦紙片貼上，不能移動；各抗菌紙片中心距離應大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應大于15mm。,紙片擴散法（Kirby-Bauer法）,6.經(jīng)過35℃16～24h孵育。7.取抑菌環(huán)直徑，根據(jù) CLSI（clinical and laboratory standards institute ）標

7、準，報 告細菌對該抗生素 敏感(susceptible,S)、 中介(intermediate,I)、 耐藥(resistant,R),E-TEST,預先制備了濃度呈連續(xù)指數(shù)增長的抗菌藥物，孵育后形成一橢圓形抑菌圈，抑菌圈和試條的相交處的刻度即為抗菌藥物對該菌的最低抑菌濃度(MIC),,CLSI AST Standards CLSI藥敏試驗標準,M100-S24 抗菌藥物敏感試驗執(zhí)行標準 (2014*)M02-A

8、11 紙片擴散法執(zhí)行標準 (2012**)M07-A9 稀釋法執(zhí)行標準(2012*)M11-A7 厭氧菌 MIC 試驗 (2007)* M100 至少每年更新一次**M02, M07 每三年更新一次,CLSI AST Standards,細菌藥敏試驗-CLSI規(guī)則,,,,,,,四、細菌的耐藥性與耐藥機制,,,,,,,絕對耐藥性(absolute resistance),獲得性耐藥(acquired resistance),

9、是指一種抗生素的天然耐藥譜(natural spectrum),,是指以前對某種細菌有效的抗生素后來出現(xiàn)了耐藥性,,細菌耐藥性,細菌的耐藥性與耐藥機制,,,,,細菌的耐藥性與耐藥機制,細菌的耐藥性與耐藥機制,細菌的耐藥性與耐藥機制,細菌的耐藥性與耐藥機制,質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移 噬菌體轉(zhuǎn)導 游離DNA轉(zhuǎn)化,細菌的耐藥性與耐藥機制,（1）介入性操作（2）各種留置導管的使用（3）修復學設備使用 （4）手術(shù)等,,條件致病菌進入

10、人體,,,細菌的耐藥性與耐藥機制,農(nóng)牧和水產(chǎn)養(yǎng)業(yè)：,在飼料中加抗生素喂養(yǎng)家畜和魚類，以利其生長，但使微生物處于不利環(huán)境中,細菌的耐藥性與耐藥機制,人群密度增高、交往頻繁：,1萬年前，地球上估計只有1-5百萬人現(xiàn)在近70億，每平方公里密度提高了國內(nèi)和國際間交往和旅游度假人數(shù)增多有利于耐藥微生物的快速傳播,細菌耐藥的表現(xiàn)形式,產(chǎn)生降解抗生素的酶或鈍化酶，改變抗生素的結(jié)構(gòu)。改變抗生素作用靶位的構(gòu)型，使之不能識別。獲得分子泵（細菌

11、主動外排系統(tǒng)）將抗生素泵出。降低細胞壁通透性，使抗生素不能進入細菌。,細菌的耐藥性與耐藥機制,?-內(nèi)酰胺酶最主要的耐藥因素對?-內(nèi)酰胺抗生素造成威脅臨床上最重要的?-內(nèi)酰胺酶超廣譜?-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）高產(chǎn)AmpC酶碳青霉烯酶,細菌的耐藥性與耐藥機制,,五、實驗室藥敏結(jié)果解析,,,,,,,,,,,,,,,,,,,臨床常見耐藥病原菌,,,,,實驗室藥敏結(jié)果解析,產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的細菌：代表菌株：大腸桿菌

12、、肺炎克雷伯氏菌、變形桿菌等腸桿菌科細菌鮑曼氏不動桿菌、綠膿桿菌等非發(fā)酵菌,,,,青霉素類,ESBLs 的 活 性,可以分解,第一代、第二代頭孢菌素,第三代頭孢菌素類,單酰胺類,比較穩(wěn)定,,頭孢西丁,頭孢替坦,碳青霉烯類(最穩(wěn)定),實驗室藥敏結(jié)果解讀,抗生素選擇：頭霉素類 含酶抑制劑復合抗生素碳青霉烯類 非β-內(nèi)酰胺類抗生素,實驗室藥敏結(jié)果解讀,實驗室藥敏結(jié)果解讀--頭孢菌素酶（AmpC

13、酶）,AmpC酶： AmpC酶是由染色體或質(zhì)粒介導的一類β-內(nèi)酰胺酶，由AmpC基因編碼的。其控制基因(AmpD基因)可突變?yōu)槌掷m(xù)高產(chǎn)酶株。近年質(zhì)粒介導的產(chǎn)AmpC酶株有明顯增多的趨勢。,AmpC酶,特點：1.能水解三代頭孢菌素、單酰胺類及頭霉素類等。2.不能被酶抑制劑所抑制 ?-內(nèi)酰胺類藥物是細菌產(chǎn)生AmpC 酶誘導劑，這些菌株一般情況下不產(chǎn) AmpC酶，除非處于被?-內(nèi)酰胺類抗生素殺死的危險時刻!,實驗室藥敏結(jié)

14、果解讀--AmpC酶,實驗室藥敏結(jié)果解讀--AmpC酶,代表細菌：腸桿菌屬菌 枸櫞酸桿菌不動桿菌 摩根摩根菌普羅威登斯菌 銅綠假單胞菌粘質(zhì)沙雷菌 嗜麥芽窄食單胞菌其他,,“腸桿菌, 枸櫞酸桿菌, 沙雷菌 對三代頭孢菌素, 銅綠假單胞菌對所有藥物，在治療3-4天后耐藥性可逐漸發(fā)展起來”。,CLSI M2-A8, M7-A6,實驗室藥敏結(jié)果解讀--AmpC酶,

15、,Follow up culture – day 3,產(chǎn)AmpC酶菌株感染的抗生素選擇第四代頭孢菌素碳青酶烯類抗生素 非β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物,,ESBLs AmpC酶耐藥 三代頭孢菌素 三代頭孢菌素 單酰胺類 單酰胺類

16、 頭霉菌素 含酶抑制劑抗生素敏感 含酶抑制劑抗生素 頭孢吡肟 頭霉菌素 碳青霉烯類 碳青霉

17、烯類 非?-內(nèi)酰胺類 非?-內(nèi)酰胺類,,,,,,根據(jù)常規(guī)藥敏試驗結(jié)果解讀細菌產(chǎn)酶情況-1,答案：單純高產(chǎn)AmpC酶,E.cloacae,答案：單產(chǎn)ESBLs酶,E.coli,,根據(jù)常規(guī)藥敏試驗結(jié)果解讀細菌產(chǎn)酶情況-2,答案：產(chǎn)ESBLs+高產(chǎn)AmpC酶,E.cloacae,根據(jù)常規(guī)藥敏試驗結(jié)果解讀細菌產(chǎn)酶情況-3,革蘭陰性菌產(chǎn)酶耐藥的經(jīng)驗治療,產(chǎn)碳青霉烯酶細菌是臨床細菌

18、耐藥一個非常棘手的問題。 碳青霉烯酶指能明顯水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗生素的一類β內(nèi)酰胺酶。,實驗室藥敏結(jié)果解讀—碳青酶烯酶,,產(chǎn)碳青霉烯酶細菌比產(chǎn)ESBLs、AmpC酶細菌具有更強的耐藥性、危害性。,避免用：青霉素、頭孢菌素和所有的β-內(nèi)酰胺類碳青酶烯類抗生素、β-內(nèi)酰胺/酶抑制劑可以用：粘菌素替加環(huán)素等四環(huán)素類氨基糖甙類抗生素氟喹諾酮類（LVF）,實驗室藥敏結(jié)果解讀—多重耐藥非發(fā)酵菌,近年來，以鮑

19、曼氏不動桿菌、綠膿桿菌為代表的多重耐藥的非發(fā)酵細菌引起的臨床感染逐漸增多。ICU、燒傷科、神經(jīng)內(nèi)外科、呼吸機使用及免疫力低下的患者常見。常常對臨床常用抗生素耐藥。這種耐藥性的產(chǎn)生是多種耐藥機制共同作用的結(jié)果：各種β-內(nèi)酰胺酶、膜通透性下降、泵出機制及生物被膜的形成等有關,銅綠假單胞菌多重耐藥機制,抗生素,實驗室藥敏結(jié)果解讀—多重耐藥非發(fā)酵菌,根據(jù)全國多家醫(yī)院的監(jiān)測結(jié)果：對于鮑曼氏不動桿菌，敏感性較好的抗生素： 碳青酶烯類抗

20、生素、頭孢哌酮/舒巴坦、氨芐西林/舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星 對于綠膿桿菌，敏感性較好的抗生素： 碳青酶烯類、頭孢他啶、阿米卡星、左氧氟沙星,實驗室藥敏結(jié)果解讀—多重耐藥非發(fā)酵菌,,,實驗室藥敏結(jié)果解讀—葡萄球菌,答案：MSSA,S.aureus,實驗室藥敏結(jié)果解讀—葡萄球菌,答案：MRSA,S.aureus,苯唑西林 R青霉素 R頭孢唑林

21、 R阿米卡星 S左氧氟沙星 R阿奇霉素 R復方新諾明 S多西環(huán)素 I萬古霉素 S,實驗室藥敏結(jié)果解析—腸球菌,耐藥性腸球菌的實驗室報告解析： 多重耐藥的腸球菌感染現(xiàn)已成為一個嚴重的問題，臨床上治療腸球菌所引起的感染的抗生素有限。 天然耐藥：復方新諾明、頭孢菌素、氨基糖苷類、克林霉素。 對于腸球菌，主要看它對青

22、霉素（氨芐西林）是否耐藥，對高濃度慶大霉素是否耐藥。,藥敏結(jié)果解析： 對青霉素敏感：可選用大劑量的青霉素或氨芐西林予以治療。 對高濃度氨基糖苷類敏感：表示與作用于細胞壁的抗菌藥物（如氨芐西林、青霉素、萬古霉素）聯(lián)合用藥時對該腸球菌菌株將具有協(xié)同作用。 對高濃度氨基糖苷類耐藥（HLAR）：表明當青霉素或糖肽類與一種氨基糖苷類抗生素聯(lián)合用藥時對該腸球菌菌株不會產(chǎn)生協(xié)同效果。,實驗室藥敏結(jié)果解析—腸球菌,實

23、驗室藥敏結(jié)果解析—腸球菌,答案：青霉素（氨芐西林）聯(lián)合慶大霉素有效,Enterococcus faecalis,氨芐西林 S高濃度慶大 S氯霉素 S左氧氟沙星 R阿奇霉素 R多西環(huán)素 I萬古霉素 S,實驗室藥敏結(jié)果解析—腸球菌,答案：HLAR株，青霉素聯(lián)合慶大霉素治療無效,Enterococcus faecalis,氨

24、芐西林 R高濃度慶大 R氯霉素 S左氧氟沙星 R阿奇霉素 R多西環(huán)素 I萬古霉素 S,青霉素耐藥肺炎鏈球菌的結(jié)果解析,1. 肺炎鏈球菌的耐藥機制 青霉素耐藥肺炎鏈球菌（PRSP）的耐藥機制是肺炎 鏈球菌有6種青霉素結(jié)合蛋白（PBP）發(fā)生改變，改變后使PBP（ β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶位）與青霉素的結(jié)合力