現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)

1、第七章 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),（3）,第一節(jié) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第二節(jié) 物理圖譜的構(gòu)建第三節(jié) 基因組測(cè)序技術(shù)第四節(jié) 分子標(biāo)記技術(shù)第五節(jié) 基因表達(dá)研究技術(shù)第六節(jié) DNA-蛋白質(zhì)相互作用 研究技術(shù),第三節(jié) 分子標(biāo)記技術(shù),一、遺傳圖譜(genetic map),遺傳圖譜(genetic map)又稱遺傳連鎖圖譜或連鎖圖譜(linkage map)。經(jīng)典遺傳 學(xué)時(shí)代的遺傳

2、連鎖圖譜主要是以家系分析或不同性狀個(gè)體間雜交為基礎(chǔ)，根據(jù)同源染色體上 等位基因的變化，通過計(jì)算重組率，確定染色體上基因座位的順序和距離，構(gòu)建基因的連鎖圖譜。,經(jīng)典遺傳圖譜,人們把單倍體配子所有染色體上的全部基因稱為一個(gè)基 因組。基因組內(nèi)每條染色體上的連鎖基因稱為一個(gè)連鎖群。繪制遺傳圖譜就是要進(jìn)行每條染 色體上基因座位的順序和距離的確定，即主要通過家系分析，對(duì)不同性狀之間、性狀與標(biāo) 記之間、標(biāo)記與標(biāo)記之間的連鎖遺傳頻率進(jìn)行計(jì)算，最終繪制遺

3、傳連鎖圖。人類遺傳圖譜包括女性一種配子的23條染色體(記作23，X)和男性兩種配子的23條染色體(23 ，X)、(23，Y)上的所有基因位點(diǎn)。,現(xiàn)代遺傳圖譜,70年代發(fā)展起來的DNA重組技術(shù)、DNA克隆技術(shù)和DNA探針技術(shù)無疑為拓展遺傳圖譜的構(gòu)建途徑創(chuàng)造了技術(shù)條件，也使人類基因定位的方法從細(xì)胞及染色體水平過渡到分子水平。DNA水平的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)作為繪制現(xiàn)代遺傳圖譜的主要界標(biāo)，大大提高圖譜的 精確度、準(zhǔn)確性。遺傳圖譜的繪制也因此進(jìn)入

4、了一個(gè)嶄新的時(shí)代。 現(xiàn)代遺傳圖譜的概念是由Botstein D等(1980)首先提出的，在此基礎(chǔ)上，限制性片段長 度多態(tài)性RFLP作為遺傳圖譜的第一代嶄新標(biāo)記得以問世 。遺傳圖譜的第二代標(biāo)記位點(diǎn)是大量的可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)（VNTR)，包括微、小衛(wèi)星(MS)或短串聯(lián)重復(fù)(STR 或SSLP)。第三代標(biāo)記是位點(diǎn)極其豐富的單核苷 酸多態(tài)性(SNP)。,二、分子標(biāo)記的概念,廣義的分子標(biāo)記(molecular marker)是指可遺傳的并可檢測(cè)的

5、DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個(gè)以上基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點(diǎn)的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNA標(biāo)記，而這個(gè)界定現(xiàn)在被廣泛采納： 能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。,三、分子標(biāo)記的種類,分子標(biāo)記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn)，大致可分為三大類。

6、第一類是以分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括：★限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（Restriction fragment length polymorphism, 簡稱RFLP標(biāo)記）；★ DNA指紋技術(shù)（DNA Fingerprinting）；★原位雜交（in situ hybridization）等；,第二類是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction ,簡稱PCR反應(yīng)）為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括：★ ★隨

7、機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（Random amplification polymorphism DNA, 簡稱RAPD標(biāo)記）；★ ★簡單序列重復(fù)標(biāo)記（Simple sequence repeat, 簡稱SSR標(biāo)記）或簡單序列長度多態(tài)性（Simple sequence length polymorphism, 簡稱SSLP標(biāo)記）；★ ★擴(kuò)展片段長度多態(tài)性標(biāo)記（Amplified fragment length polymorphism,

8、簡稱AFLP標(biāo)記）；★ ★序標(biāo)位（Sequence tagged sites, 簡稱STS標(biāo)記）；★ ★序列特征化擴(kuò)增區(qū)域（Sequence charactered amplified region, 簡稱SCAR標(biāo)記）等；,第三類是一些新型的分子標(biāo)記，如：★ ★單核苷酸多態(tài)性（Single nuleotide polymorphism, 簡稱SNP標(biāo)記）；★ ★表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequences tags,

9、簡稱EST標(biāo)記）等。,四、分子標(biāo)記的特點(diǎn),（1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè)到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問題；（2）數(shù)量極多，遍布整個(gè)基因組，可檢測(cè)座位幾乎無限；（3）多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創(chuàng)造；（4）表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；（5）許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜合體。,五、幾種常用的分子標(biāo)記,（一）限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（Restric

10、tion fragment length polymorphism, RFLP） 該技術(shù)由Grodzicker等于1974年創(chuàng)立。 特定生物類型的基因組DNA經(jīng)某一種限制性內(nèi)切酶完全酶解后，會(huì)產(chǎn)生分子量不同的同源等位片段，或稱限制性等位片段。RFLP標(biāo)記技術(shù)的基本原理就是通過電泳的方法分離和檢測(cè)這些片段。凡是可以引起酶解位點(diǎn)變異的突變，如點(diǎn)突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn)）和一段DNA的重新組織

11、（如插入和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致限制性等位片段的變化，從而產(chǎn)生RFLP。,EcoRⅠ酶切示意圖,5’ AG----GAATTC---GAATTC----GAATTC---CG 3’3’ TC----CTTAAG---CTTAAG----CTTAAG---GC 5’ AG----G AATTC---G AATTC----G AATTC---CG TC----CTTAA G---CTTAA

12、 G----CTTAA G---GC5’ AG----GAATTC---GAATCC----GAATTC---CG 3’3’ TC----CTTAAG---CTTAGG----CTTAAG---GC 5’ AG----G AATTC---GAATCC----G AATTC---CG TC----CTTAA G---CTTAGG----CTTAA G---CG,基本步驟： DNA提取→用DN

13、A限制性內(nèi)切酶消化 →凝膠電泳分離限制性片段 →將這些片段按原來的順序和位置轉(zhuǎn)移到易操作的濾膜上 →用放射性同位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA作探針與膜上的DNA雜交（稱 Southern雜交） →放射性自顯影或酶學(xué)檢測(cè)顯示出不同材料對(duì)該探針的限制性酶切片段多態(tài)性。,RFLP標(biāo)記的主要特點(diǎn)有：（1）遍布于整個(gè)基因組，數(shù)量幾乎是無限的；（2）無表型效應(yīng)，不受發(fā)育階段及器官特異性限制；（

14、3）共顯性，可區(qū)分純合子和雜合子；（4）結(jié)果穩(wěn)定、可靠；（5）DNA需要量大，檢測(cè)技術(shù)繁雜，難以用于大規(guī)模的育種實(shí)踐中。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,A,B,A,B,限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),與放射性探針結(jié)合部位,①限制性內(nèi)切酶酶切后；②電泳分離DNA片段；③轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜；④與放射性探針雜交，⑤分析陽性條帶,（二）染色體原位雜交,染色體原位雜交技術(shù)是DNA探針與染色體上的DNA雜

15、交，并在染色體上直接進(jìn)行檢測(cè)的分子標(biāo)記技術(shù)。目前發(fā)展最快的是熒光素標(biāo)記的原位DNA雜交技術(shù)，即熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization, 簡稱FISH技術(shù)），是利用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與抗原標(biāo)記的探針分子特異性的結(jié)合來檢測(cè)DNA序列在染色體上的位置。,熒光標(biāo)記原位雜交原理示意圖,原位雜交技術(shù)的基本步驟為,制備探針；染色體制片；染色體處理與變性；染色體與探針雜交；顯微檢測(cè)。,

16、染色體專一位點(diǎn)探針,,熒光標(biāo)記探針檢測(cè)精子,（三） 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD),由Williams等于1990年創(chuàng)立。其基本原理與PCR技術(shù)一致。 RAPD標(biāo)記技術(shù)就是用一個(gè)（有時(shí)用兩個(gè)）隨機(jī)引物（一般8-10個(gè)堿基）非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增基因組DNA，然后用凝膠電泳分開擴(kuò)增片段。遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)

17、生分子量變化。若PCR產(chǎn)物增加或缺少，則產(chǎn)生RAPD標(biāo)記。,親本中國春小麥、節(jié)節(jié)麥雙倍體和子代的RAPD電泳圖譜,引物為S516: CTCTGCGCGT 泳道1為中國春小麥，泳道2、二者的子代，泳道3為節(jié)節(jié)麥。,RAPD擴(kuò)增克隆魚(B)、供體紅鯉(A)、受體金魚(D)和雜交魚(C，即A♂xD♀)的細(xì)胞核DNA指紋圖譜。結(jié)果顯示，對(duì)于不同的引物，克隆魚的擴(kuò)增譜帶均和供體紅鯉的一致，迥異于受體金魚和雜交魚。,RAPD標(biāo)記

18、的主要特點(diǎn)有：（1）不需DNA探針，設(shè)計(jì)引物也無須知道序列信息；（2）顯性遺傳（極少數(shù)共顯性），不能鑒別雜合子和純合子；（3）技術(shù)簡便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)；（4）DNA樣品需要量少，引物價(jià)格便宜，成本較低；（5）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。,（四）簡單序列重復(fù)標(biāo)記，SSR,又稱微衛(wèi)星DNA(Micro-satellite DNA)標(biāo)記；屬高度重復(fù)序列，重復(fù)單元2~6bp，如(CA)n、(AT)、(GGC)

19、n等重復(fù)，重復(fù)區(qū)大多幾十~幾百bp，分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內(nèi)，具有較高的多態(tài)性。呈現(xiàn)孟德爾式遺傳。目前微衛(wèi)星DNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了２萬余個(gè)位點(diǎn)。,TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG,,,,,,微衛(wèi)星DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果（示例）：,500bp400bp300bp240bp,該結(jié)果顯示在所檢查的人群中，該位點(diǎn)多態(tài)性

20、有4種。,,SSR標(biāo)記的主要特點(diǎn),（1）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個(gè)基因組；（2）具有較多的等位性變異；（3）共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子；（4）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；（5）由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時(shí)需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，因此其開發(fā)有一定困難，費(fèi)用也較高。,（五）單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism SNP),1. 定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異

21、所引起的DNA序列多態(tài)性。 不同個(gè)體間，基因組DNA某部位的 單核苷酸的變異。1996年，Lander報(bào)道了用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（single nucleotid polymorphism SNP）制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標(biāo)記。,2. SNP在人類基因組中出現(xiàn)的頻率,SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)1700萬個(gè)甚至更多。

22、 There is one SNP in every 1000 bases leads to an estimate that any two individuals differ by up to three million SNPs. 在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩碚f，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(codin

23、g sNP,cSNP)比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。,3. SNP檢測(cè)方法,目前已有多種方法可用于SNP檢測(cè)：★根據(jù)DNA列陣的微測(cè)序法；★動(dòng)態(tài)等位基因特異的雜交；★寡聚核苷酸特異的連接；★ DNA芯片以及TaqMan系統(tǒng)等。但不管哪一種方法，首先必須進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增，然后才能進(jìn)行其它檢測(cè)。,4. SNP用作遺傳標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn),(1) SNP

24、在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計(jì)出來。(2)它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛得多。(3)與串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)相比，SNP是高度穩(wěn)定的，尤其是處于編碼區(qū)的SNP(cSNP),而前者的高突變率容易引起對(duì)人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。(4)部分位于基因內(nèi)部的SNP可能會(huì)直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機(jī)制的候選改變位點(diǎn)。(5)易于進(jìn)行自動(dòng)化分析，縮短了研究時(shí)間。,5. S

25、NP的意義,對(duì)于人類來說，SNP的意義在于：１、致病SNP２、疾病易感性SNP３、具有診斷價(jià)值的SNP４、疾病的SNP譜５、人表型相關(guān)SNP６、藥物作用與不良反應(yīng)的SNP７、藥物劑量SNP,日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)糖尿病基因的個(gè)人SNP差別,日本研究人員最近經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，與糖尿病有關(guān)的基因并不是千篇一律，它們之間存在著個(gè)人差別，即“單核苷酸多態(tài)性”（SNP）。,,預(yù)計(jì)今后SNP將在下列領(lǐng)域發(fā)揮重要作用：(1)進(jìn)行簡單和復(fù)雜疾病的遺傳

26、連鎖分析(linkage analysis)及關(guān)聯(lián)分析(association analysis),用于疾病易感基因定位；而且其定位的精度將比微衛(wèi)星標(biāo)記精細(xì)得多，可直接用于指導(dǎo)易感基因克隆。(2)在“藥物基因組學(xué)”(pharmacogenomics)研究中，可通過檢測(cè)SNP的遺傳多態(tài)性標(biāo)記揭示人群中不同個(gè)體對(duì)不同藥物的敏感性差異的根本原因。(3)也可用于法醫(yī)研究的罪犯身份的鑒別、親子鑒定等，此外在器官移植中供體和受體間的配對(duì)選擇及物

27、種進(jìn)化的研究中都將具有重要意義。,分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用,分子遺傳圖譜的構(gòu)建遺傳多樣性與種質(zhì)鑒定重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的定位分子標(biāo)記輔助選擇 重要農(nóng)藝性狀的圖位克隆,,瀏覽以下網(wǎng)站國內(nèi)： 天大生物信息中心http://tubic.tju.edu.cn 北大生物信息中心 http://cbi.pku.edu.cn 中國生物信息http://www.biosino.org/國外 美國國家生物

28、技術(shù)信息中心(NCBI) http://ncbi.nlm.nih.gov 歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI) http://www.ebi.ac.uk,http://www.sdsy.net/sw/03.htm,SNP在“藥物基因組學(xué)”(pharmacogenomics)研究中應(yīng)用,不同個(gè)體的藥物反應(yīng)（主要指藥效與毒性）差異與DNA多態(tài)性的關(guān)系。即通過DNA序列差異

29、的分析，從基因水平上深入認(rèn)識(shí)疾病及藥物作用的個(gè)體差異的機(jī)理，指導(dǎo)和優(yōu)化臨床用藥。并有可能在此基礎(chǔ)上發(fā)展個(gè)體化醫(yī)療,SNPs affecting drug effects,Polymorphisms in enzymes that metabolize drugs are responsible for unexpected toxicity after administration of a normal drug dose.SNPs

30、 in the coding regions of genes of the enzymes necessary for the biotransformation of endogenous and exogenous compounds can decrease or even prevent drug metabolism.,Cytochrome P450,細(xì)胞色素Ｐ450 (CYP)同功酶是藥物代謝酶并顯示了基

31、因多態(tài)性。人體內(nèi)有六種不同的細(xì)胞色素Ｐ450 ：CYP1A2 , CYP2C9, CYP2C1 9, CYP2D6, CYP2E1和CYP3A4負(fù)責(zé)清理體內(nèi)藥物。 CYP2C9, CYP2C1 9, CYP2D6的多態(tài)性與個(gè)體間差異有很大關(guān)聯(lián)性。如果有人缺失這種酶 ,常常被稱為‘差的’或‘慢的’藥物代謝體ＰＭ(poor metabolizer), 這種人有較大的高藥物濃度中毒的可能性 ;如果有高活性或過量的這些酶 ,就被稱為‘快速的’