9.植物種質(zhì)資源的離體保存(植物組織培養(yǎng))

1、第九章第九章植物種質(zhì)資源的離體保存植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)種質(zhì)：是指親代通過(guò)生殖細(xì)胞或體細(xì)胞直接傳遞給子代并決定固有生物性狀的遺傳物質(zhì)。植物種質(zhì)資源植物種質(zhì)資源（又稱(chēng)品種資源、遺傳資源或基因資源）是生物多樣性的重要組成部分，是選育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗?。ㄏx(chóng)）、抗逆新品種的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生物技術(shù)研究取之不盡的基因來(lái)源。種質(zhì)資源越多，其多樣性越豐富，改良品種或選育新品種的潛力就越大改良品種或選育新品種的潛力就越大。未來(lái)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)在很大程度上取決于

2、對(duì)種質(zhì)資源的占有量和利用程度，故保持生物多樣性有重要意義。種質(zhì)保存種質(zhì)保存：是指利用天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境，借以保存種質(zhì)資源，使個(gè)體中所含有的遺傳物質(zhì)保持其遺傳完整性，并且有強(qiáng)的生活力，能通過(guò)繁殖將其遺傳特性傳遞下去。植物種質(zhì)資源保存的方式植物種質(zhì)資源保存的方式有原生境保存和非原生境保存。原生境保存原生境保存是指在原來(lái)的生態(tài)環(huán)境中，就地進(jìn)行繁殖保存種質(zhì)，如建立自然保護(hù)區(qū)或保護(hù)小區(qū)，甚至保護(hù)點(diǎn)等途徑來(lái)保護(hù)作物及經(jīng)濟(jì)林木的野生近緣植物物種

3、；非原生境保存非原生境保存是指種質(zhì)保存于該植物原生態(tài)生長(zhǎng)地以外的地方，包括異地保存（種質(zhì)圃或植物園保存）、種質(zhì)庫(kù)（種子）保存、離體（試管）保存等。原生境保存和異地保存固然有其明顯的重要性，但要保存大量種質(zhì)，則需耗費(fèi)巨大的人力、物力和土地，在實(shí)際中很難實(shí)施，而且易受自然災(zāi)害、蟲(chóng)害和病害的侵襲，造成植物種質(zhì)資源的喪失。以種子的形式保存以種子的形式保存時(shí)，所占的空間較小，并且能夠保存很多年，種子容易干燥、包裝，便于運(yùn)輸?shù)揭N中心和基因庫(kù)。種子

4、保存存在的限制因素種子保存存在的限制因素：①種子生活力隨貯存期的延長(zhǎng)會(huì)逐漸喪失；②無(wú)性繁殖的植物（如蘋(píng)果、柑橘、甘薯、馬鈴薯等）難于采用種子保存；③采用無(wú)性繁殖來(lái)保持其優(yōu)良性狀的植物（如許多果樹(shù)），用種子繁殖后代會(huì)發(fā)生變異；④頑拗型種子植物（芒果、椰子、油棕和咖啡等）因其種子不易干燥脫水和低溫貯藏，不宜用種子保存或保存難度很大；⑤有些植物種質(zhì)是不產(chǎn)生種子的，如臍橙、香蕉等；⑥易遭自然災(zāi)害襲擊而使種質(zhì)資源丟失。種質(zhì)資源離體保存種質(zhì)資源離體

5、保存是指對(duì)離體培養(yǎng)的小植株、器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等材料，采用限制、延緩或停止其生長(zhǎng)的處理措施使之保存，在需要時(shí)可重新恢復(fù)其生長(zhǎng)，并再生植株的方法。離體種質(zhì)保存有以下優(yōu)點(diǎn)：離體種質(zhì)保存有以下優(yōu)點(diǎn)：①所占空間少，節(jié)省人力、物力和土地；②有利于國(guó)際間的種質(zhì)交流及瀕危物種搶救和快繁；③需要時(shí)，可以用離體培養(yǎng)方法很快大量繁殖；④避免自然災(zāi)害引起的種質(zhì)丟失。上世紀(jì)70年代以來(lái)，人們把冷凍生物學(xué)冷凍生物學(xué)和植物離體培養(yǎng)技術(shù)植物離體培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合起

6、來(lái)，發(fā)展了離體種質(zhì)資源冷凍保存離體種質(zhì)資源冷凍保存或超低溫保存技術(shù)超低溫保存技術(shù)。第一節(jié)第一節(jié)植物種質(zhì)資源的常溫限制生長(zhǎng)保存植物種質(zhì)資源的常溫限制生長(zhǎng)保存一、常溫限制生長(zhǎng)保存的概念在正常條件下的組織培養(yǎng)不適合種質(zhì)保存在正常條件下的組織培養(yǎng)不適合種質(zhì)保存。因?yàn)樵谶@種條件下，材料生長(zhǎng)很快，需經(jīng)常進(jìn)行轉(zhuǎn)接。不僅使保存工作量加大費(fèi)用升高，也導(dǎo)致在轉(zhuǎn)接中污染和由取樣的隨機(jī)性造成基因資源的丟失。因此，理想的保存方法是使培養(yǎng)物處于無(wú)生長(zhǎng)或緩慢生長(zhǎng)狀態(tài)

7、下抑制植物的生長(zhǎng)理想的保存方法是使培養(yǎng)物處于無(wú)生長(zhǎng)或緩慢生長(zhǎng)狀態(tài)下抑制植物的生長(zhǎng)，減少繼代次數(shù)，達(dá)到長(zhǎng)期保存目的。需要時(shí)可以迅速恢復(fù)正常生長(zhǎng)需要時(shí)可以迅速恢復(fù)正常生長(zhǎng)。抑制生長(zhǎng)的外植體可以是莖段、莖尖及愈傷組織。二、常溫限制生長(zhǎng)保存的方法和原理二、常溫限制生長(zhǎng)保存的方法和原理（一）高滲保存法高滲保存法高滲保存法是指通過(guò)提高培養(yǎng)基的滲透壓，減少離體培養(yǎng)物從培養(yǎng)基中吸收養(yǎng)分和水分的量，減緩生理代謝過(guò)程，從而減緩生長(zhǎng)速度，達(dá)到抑制培養(yǎng)物生長(zhǎng)的

8、保存方法。（繼代培養(yǎng)間隔時(shí)間可延長(zhǎng)到1年）方法：方法：1）提高蔗糖濃度：）提高蔗糖濃度：10%左右，就可達(dá)到抑制培養(yǎng)物生長(zhǎng)的目的。由于蔗糖是組培中最常用的碳源和能源，提高滲透壓的同時(shí)又對(duì)材料生理代謝產(chǎn)生不利的影響。2）添加惰性物質(zhì)：）添加惰性物質(zhì)：如甘露醇、山梨醇等都是優(yōu)良的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)，這樣可以使其限制離體培養(yǎng)物生長(zhǎng)的作用維持更久。一般用4%～6%甘露醇處理培養(yǎng)基，或用2%～3%蔗糖加2%～5%的甘露醇混合處理。3）增加培養(yǎng)基中瓊脂

9、的用量來(lái)提高滲透壓）增加培養(yǎng)基中瓊脂的用量來(lái)提高滲透壓，降低培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速率。（二）生長(zhǎng)抑制劑保存法在離體種質(zhì)保存中使用植物生長(zhǎng)抑制劑可以延緩或抑制離體培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)繼代時(shí)間以達(dá)到離體保存種質(zhì)的目的。生長(zhǎng)抑制劑保存法生長(zhǎng)抑制劑保存法是指在培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)抑制劑或延緩劑如ABA、青鮮素、矮壯素（CCC）、B9、多效唑、烯效唑等。（三）常溫限制生長(zhǎng)的其他保存法大冰晶，細(xì)胞不易受害。2提高培養(yǎng)基滲透壓提高培養(yǎng)基滲透壓用甘露醇、山梨醇和蔗糖

10、等提高培養(yǎng)基滲透壓，以提高培養(yǎng)組織和細(xì)胞的滲透壓來(lái)提高抗寒力。如在含8%蔗糖的改良MS液體培養(yǎng)基振蕩預(yù)培養(yǎng)6d，紅豆杉愈傷組織在超低溫保存后細(xì)胞活力可保持最高。3添加冷凍防護(hù)劑添加冷凍防護(hù)劑冷凍防護(hù)劑在溶液中能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的水合作用，提高溶液的黏滯性，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免遭凍害。用冷凍防護(hù)劑對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理可明顯提高細(xì)胞的存活率和再生能力。常用的冷凍防護(hù)劑：58%二甲基亞砜（DMSO)、甘油、10%脯氨酸。糖類(lèi)、PEG、乙酰胺、糖醇和福美氧化硫

11、等。DMSO是最好的防護(hù)劑。是最好的防護(hù)劑。有時(shí)常把幾種冷凍防護(hù)劑混合使用，降低冷凍防護(hù)劑的毒性，提高細(xì)胞存活率和再生能力。4低溫預(yù)處理低溫預(yù)處理低溫預(yù)處理是將離體培養(yǎng)物置于一定的低溫環(huán)境中（0～4℃），使其接受低溫鍛煉，細(xì)胞內(nèi)可溶性糖及其類(lèi)似的具有低溫保護(hù)功能的物質(zhì)積累，束縛水自由水比值增大，原生質(zhì)的黏度、彈性增大，代謝活動(dòng)減弱，提高其抗寒能力。（三）降溫冷凍及超低溫保存1傳統(tǒng)的降溫冷凍方法傳統(tǒng)的超低溫冷凍保存方法是通過(guò)預(yù)培養(yǎng)、冷凍保

12、護(hù)劑處理、降溫速度和轉(zhuǎn)移溫度預(yù)培養(yǎng)、冷凍保護(hù)劑處理、降溫速度和轉(zhuǎn)移溫度等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，創(chuàng)造合適的保護(hù)性脫水程度，實(shí)現(xiàn)超低溫保存種質(zhì)資源。從降溫方式來(lái)看，超低溫冷凍保存方法有快速冷凍法、慢速冷凍法、兩步冷凍法和逐級(jí)冷凍法快速冷凍法、慢速冷凍法、兩步冷凍法和逐級(jí)冷凍法等幾種。1傳統(tǒng)的降溫冷凍方法傳統(tǒng)的降溫冷凍方法（1）快速冷凍法：）快速冷凍法：將保存材料從0℃或其它預(yù)培養(yǎng)溫度直接投入液氮中保存。其降溫速度在1000℃min以上。適于材料：適于材

13、料：高度脫水的植物材料（如種子、花粉、球莖或塊根等）、經(jīng)過(guò)冬季的低溫鍛煉抗寒性較強(qiáng)的木本植物的枝條和芽。原理：原理：細(xì)胞內(nèi)的水分在降溫冷凍過(guò)程中，－140℃～－10℃是冰晶形成和增長(zhǎng)的危險(xiǎn)溫度區(qū)，在－140℃以下，冰晶不再增長(zhǎng)，快速冷凍法就是利用了在液氮中溫度驟然降低到最低點(diǎn)（－196℃），使細(xì)胞內(nèi)水分迅速通過(guò)冰晶生成的危險(xiǎn)溫度區(qū)，產(chǎn)生的玻璃化狀態(tài)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生破壞作用，從而減輕或避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰所造成的危害。（2）慢速冷凍法：）慢速冷

14、凍法：在冷凍保護(hù)劑存在下，以0.1～10℃min降溫速度從0℃降到－70℃，接著浸入液氮中進(jìn)行冷凍保存。這樣可以使細(xì)胞內(nèi)的水分有充足的時(shí)間流到細(xì)胞外結(jié)冰，從而使細(xì)胞內(nèi)的水分減少到最低限度，避免細(xì)胞內(nèi)形成冰晶；同時(shí)又能防止因溶質(zhì)含量增加引起的“溶液效應(yīng)”的毒害。適合材料：適合材料：大多數(shù)植物離體種質(zhì)的保存，即使是體積較大、液泡大、含水量較高的植物材料，也可以用此法保存得到較好的保存效果。慢速冷凍法需要配備程序降溫器，技術(shù)系統(tǒng)昂貴。（3）兩

15、步冷凍法：）兩步冷凍法：慢速冷凍和快速冷凍結(jié)合起來(lái)的一種冰凍方法。在冷凍保護(hù)劑存在下，先用慢速冷凍法（降溫速度0.1～4℃min）降到轉(zhuǎn)移溫度（一般為－70℃～－40℃），在此溫度下平衡0.5～2h，使細(xì)胞達(dá)到保護(hù)性脫水狀態(tài)；然后投入液氮中迅速冷凍。目前，大多采用0.5～4℃min的降溫速度降到－40℃，然后投入液氮保存。（4）逐級(jí)冷凍法：）逐級(jí)冷凍法：材料經(jīng)保護(hù)劑在0℃預(yù)處理后，依次經(jīng)過(guò)－10℃、－15℃、－23℃、－40℃、－70℃

16、等溫度處理，在每級(jí)溫度上停留一定時(shí)間（約5min），然后浸入液氮。2玻璃化保存法玻璃化保存法液體固化方式：液體固化方式：①形成尖銳的冰晶；②進(jìn)入無(wú)定形的非晶體（玻璃化）狀態(tài)。玻璃化玻璃化是指液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷w（玻璃態(tài)）的固化過(guò)程。玻璃化法超低溫保存種質(zhì)資源玻璃化法超低溫保存種質(zhì)資源就是將生物材料經(jīng)高濃度玻璃化保護(hù)劑處理使其快速脫水后直接投入液氮，使生物材料和玻璃化保護(hù)劑發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變，進(jìn)入玻璃化狀態(tài)。此間水分子沒(méi)有發(fā)生重排，不形成冰晶，也

17、不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和體積的變化，因而不會(huì)由于細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰造成機(jī)械損傷或溶液效應(yīng)而傷害組織和細(xì)胞，保證快速化凍后細(xì)胞仍有活力。特點(diǎn)：特點(diǎn)：與傳統(tǒng)的超低溫保存方法相比，玻璃化法操作簡(jiǎn)單、重演性好，避免了一些種質(zhì)的冷敏感問(wèn)題，并且在復(fù)雜的組織和器官的超低溫保存方面有較好的應(yīng)用潛力，因而是一種較理想的超低溫保存方法。但由于PVS（plantvitrificationsolution）保護(hù)劑濃度很高，對(duì)材料毒害性極大，因此需嚴(yán)格控制脫水過(guò)程及冰凍保護(hù)劑的滲

18、透性。3包埋脫水法超低溫保存包埋脫水法超低溫保存包埋脫水法包埋脫水法是將包含有樣品的褐藻酸鈉溶液滴向高鈣溶液，因褐藻酸鈣的生成而固化成球狀顆粒，然后將包埋后含有保存材料的藻酸鈣小珠在含有高濃度蔗糖的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)，使樣品獲得高的抗凍力和抗脫水力后，結(jié)合適當(dāng)?shù)拿撍徒禍胤绞剑詈蠼胍旱斜４?。特點(diǎn)：特點(diǎn)：與玻璃化法相比，包埋脫水法采用高濃度的蔗糖預(yù)處理樣品，對(duì)低溫保護(hù)劑敏感的植物樣品有著很大的應(yīng)用潛力。包埋脫水法也不需要昂貴、復(fù)雜的降溫