牛體細(xì)胞核移植線粒體單倍型作用機(jī)制的研究.pdf

1、本文研究了牛體細(xì)胞核移植線粒體單倍型作用機(jī)制。 體細(xì)胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer,SCNT）技術(shù)為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)提供了一條有效途徑，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),然而效率低下是限制該技術(shù)的瓶頸。克隆胚胎的發(fā)育明顯依賴于供體核和受體卵母細(xì)胞的相互作用。由于卵母細(xì)胞在植入前發(fā)育中的重要作用，受體卵母細(xì)胞日益成為核移植技術(shù)中的研究熱點(diǎn)。線粒體是細(xì)胞質(zhì)中含量最多的細(xì)胞器并行使多種生物學(xué)功能。線粒體DNA(mi

2、tochondrial DNA,mtDNA)是核外存在的遺傳物質(zhì)并受控于核基因，這使mtDNA 成為研究核質(zhì)互作的良好材料。由于線粒體DNA 的高突變率和多態(tài)性，形成多種不同的單倍型類別。大量研究資料證明，不同母本來源的線粒體可明顯影響胚胎發(fā)育的效率。 本課題通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血全長(zhǎng)mtDNA 分為六段進(jìn)行擴(kuò)增，隨后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用合適的限制性內(nèi)切酶( AvaⅡ、BamHⅠ、BglⅡ、HpaⅠ、NlaⅢ、Ps

3、tⅠ)消化繪制限制性酶切圖譜，并以此為依據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劃分為A、B、C、D 四種線粒體單倍型。四種單倍型在群體中的頻率分別為29.4％、13.5％、51.8％和3.6％。 選取A 型和C 型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過活體取卵技術(shù)(Ovum Pick-Up,OPU)獲得卵母細(xì)胞，體外成熟后用于核移植。結(jié)果顯示，A 型卵母細(xì)胞與C 型卵母細(xì)胞相比，核移植后融合率(64.6％和53.6％)和囊胚發(fā)育率(39.4％和26.3％)明顯高于后者，證明不

4、同類型卵母細(xì)胞對(duì)核移植效率有明顯的影響。隨后選取A型和C 型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物卵丘細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)作為供核細(xì)胞，分別于A 型和C 型卵母細(xì)胞組合進(jìn)行核移植操作。結(jié)果顯示，供核細(xì)胞與卵母細(xì)胞均為A 型時(shí)克隆胚胎的囊胚發(fā)育率最高(25.9％),明顯高于其它組合方式(分別為15.9％、7.0％和17.2％),提示當(dāng)供核細(xì)胞和卵母細(xì)胞同為A 型時(shí)最有利于克隆胚胎的發(fā)育。 分別檢測(cè)了A型和C型卵母細(xì)胞在體外成熟前后(生發(fā)泡期，GV期；減數(shù)分裂Ⅱ期

5、，MⅡ期)線粒體拷貝數(shù)和ATP含量。結(jié)果顯示，線粒體拷貝數(shù)在處于同一時(shí)期的A型和C型卵母細(xì)胞中差異明顯(GV期：5.03±0.69/A型卵母細(xì)胞,4.81±0.86/C型卵母細(xì)胞,P<0.05；MⅡ期：5.31±0.71/A型卵母細(xì)胞，5.13±0.63/C型卵母細(xì)胞,P<0.05)。同樣，不同類型卵母細(xì)胞體外成熟前ATP含量存在明顯差異(A型卵母細(xì)胞：1.67±0.09pmol/卵C型卵母細(xì)胞：1.27±0.10pmol/卵，P<0.

6、01),而在體外成熟后兩者ATP含量均有明顯升高且不同類型間差異明顯(A型卵母細(xì)胞：5.18±0.07 pmol/卵C型卵母細(xì)胞：2.68±0.03 pmol/卵， P<0.05 )。在檢測(cè)由線粒體編碼(COXⅠ、COXⅢ)和核基因編碼(COXⅣ、COXⅤa) 的能量相關(guān)基因表達(dá)水平時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)不同類型卵母細(xì)胞間各基因的表達(dá)水平并不一致，其中A型卵母細(xì)胞COXⅠ(3.3±2.0×103/卵vs. 0.68±0.45×103/卵)、COX

7、Ⅲ（24.9±10.5×103/卵vs. 9.4±3.3×103/卵）和COXⅣ（5.0±1.0×103/卵vs. 3.0±1.5×103/卵）的表達(dá)水平明顯高于C型卵母細(xì)胞，而COXⅤa（5.8±3.5×103/卵vs. 5.9±1.0×103/卵）在兩者間并無明顯差異。 本課題將核移植技術(shù)與活體取卵技術(shù)相結(jié)合，將分子生物學(xué)技術(shù)與胚胎工程技術(shù)相結(jié)合，試圖為提高克隆牛的效率以及乳腺生物反應(yīng)器的研制探索一條有效的途徑，具有重要的