生物化學(xué)重點(diǎn)串講(6)

1、第九章第九章DNA的生物合成（復(fù)制）的生物合成（復(fù)制）目標(biāo)：1.掌握DNA復(fù)制的概念、特點(diǎn)和參與復(fù)制的酶與蛋白質(zhì)。比較原核細(xì)胞DNA復(fù)制與真核細(xì)胞DNA復(fù)制的不同。2.掌握反轉(zhuǎn)錄的概念、反轉(zhuǎn)錄酶、主要反應(yīng)過程。導(dǎo)入：DNA的生物合成反應(yīng)有三種方式：DNA指導(dǎo)的DNA合成，RNA指導(dǎo)的DNA合成和修復(fù)合成。第一種就是DNA復(fù)制，是最主要的合成方式。復(fù)制是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。堿基配對(duì)規(guī)律和DNA雙螺旋結(jié)

2、構(gòu)是復(fù)制的分子基礎(chǔ)，其化學(xué)本質(zhì)是酶促的生物細(xì)胞內(nèi)單核苷酸聚合。本章重點(diǎn)講述復(fù)制的特點(diǎn)、機(jī)制和過程。第一節(jié)DNA的復(fù)制自從1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和DNA半保留復(fù)制假說后，關(guān)于遺傳信息的傳遞，科學(xué)界出現(xiàn)了一場(chǎng)空前熱烈的探索。遺傳信息以密碼的形式編碼在DNA分子上，通過DNA復(fù)制由親代傳遞給子代；在子代的生長(zhǎng)發(fā)育過程中又自DNA轉(zhuǎn)錄給RNA，然后翻譯成特異的蛋白質(zhì)，以執(zhí)行各種功能，使后代現(xiàn)出與親代相似的遺

3、傳性狀。一、DNA的半保留復(fù)制（semiconservationreplication）1.概念：DNA復(fù)制的一種方式。每條鏈都可作為合成互補(bǔ)鏈的模板，合成出的兩分子雙鏈DNA，每個(gè)分子都是由一條親代鏈和一條新鏈組成。2.實(shí)驗(yàn)證明：1958年，Meselson和Stahl通過一個(gè)著名的實(shí)驗(yàn)證明了Watson和Crick的推測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是以大腸桿菌為材料，培養(yǎng)基以15N標(biāo)記的NH4Cl作為N的惟一來源（重氮培養(yǎng)基）。經(jīng)過15代傳代培養(yǎng)，使

4、其DNA全部變成[15N]DNA。然后轉(zhuǎn)移到輕氮培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣，對(duì)DNA進(jìn)行分析（CsCl密度梯度離心），其結(jié)果呈規(guī)律性的變化：在0代細(xì)菌中，DNA雙鏈中氮的分布為15N15N，對(duì)DNA密度梯度離心，得浮力密度為1.724gml；在第1代細(xì)菌中，DNA雙鏈中氮的分布由15N15N轉(zhuǎn)為15N14N，其浮力密度為1.717gml；在第1代以后的細(xì)菌中，DNA雙鏈中氮分布有兩種，即15N14N和14N14N；隨著傳代次數(shù)的增

5、加，雙鏈均含14N的DNA的比重越來越高。1963年Cairus用放射自顯影的方法第一次觀察到完整的正在復(fù)制的大腸桿菌染色體DNA。3.意義：半保留復(fù)制是DNA復(fù)制最重要的特征。這種方式使子代保留了親代DNA的全部遺傳信息，說明DNA在代謝上的穩(wěn)定性。物種穩(wěn)定的分子基礎(chǔ)就是遺傳的相對(duì)保守性，體現(xiàn)在代與代之間DNA堿基序列的一致性，或者說某種生物的后代只能是它的同種生物而不是其他。二、DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方式基因組能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位稱為復(fù)

6、制子（replicon）。每個(gè)復(fù)制子都含有控制復(fù)制起始的起點(diǎn)（igin），可能還有終止復(fù)制的終點(diǎn)（terminus）。（一）環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制大腸桿菌DNA復(fù)制始于單一起點(diǎn)或原點(diǎn)（iC），雙向、等速、對(duì)稱進(jìn)行。在電鏡下復(fù)制的起點(diǎn)與復(fù)制的DNA部分猶如眼睛，稱復(fù)制眼，包括兩個(gè)反向運(yùn)動(dòng)的復(fù)制叉（replicationfk），形成θ型。復(fù)制叉移動(dòng)速度約50000bpmin。染色體完成復(fù)制需要40min。某些病毒及噬菌體DNA復(fù)制時(shí)，可以觀察

7、到單向滾環(huán)型復(fù)制。在哺乳類動(dòng)物線粒體DNA復(fù)制中發(fā)現(xiàn)，兩條鏈的合成是高度不對(duì)稱，一條鏈上迅速合成出互補(bǔ)鏈，另一條則為游離的單鏈環(huán)（即D環(huán)）。（二）線性DNA雙鏈的復(fù)制真核生物染色體DNA是線性雙鏈分子，含有許多復(fù)制起點(diǎn)，因此是多復(fù)制子。雖然其復(fù)制四、DNA半不連續(xù)復(fù)制DNA分子的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫星一パa(bǔ)的，而所有已知的DNA聚合酶的合成方向都是5′→3′。這很難說明DNA在復(fù)制時(shí)兩條鏈同時(shí)作為模板合成新的互補(bǔ)鏈。為了解決這個(gè)矛盾，1968

8、年日本學(xué)者岡崎通過實(shí)驗(yàn)研究(3H標(biāo)記的脫氧胸苷的密度梯度離心技術(shù))，提出了半不連續(xù)復(fù)制理論。DNA解鏈復(fù)制時(shí)，以3′→5′走向?yàn)槟０宓膹?fù)制鏈可順著解鏈方向延長(zhǎng)，其復(fù)制過程是連續(xù)的，此鏈稱為前導(dǎo)鏈（leadingstr）。而沿著解鏈方向5′→3′模板鏈合成的互補(bǔ)鏈，出現(xiàn)了復(fù)制方向與解鏈方向相反，此時(shí)，必須等模板鏈解出足夠長(zhǎng)度，在引物3′OH末端，沿5′→3′方向先合成小的DNA片段（岡崎片段），這些片段是不連續(xù)的，最后連成一條完整的鏈，稱

9、后隨鏈（laggingstr）。前導(dǎo)鏈的連續(xù)性在許多因素作用下也會(huì)出現(xiàn)不連續(xù)性。如模板鏈的損傷、一條鏈上有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)、復(fù)制因子和底物供應(yīng)不足等，都會(huì)引起前導(dǎo)鏈復(fù)制的中斷，并從一新的起始點(diǎn)開始復(fù)制。前導(dǎo)鏈和后隨鏈?zhǔn)侵竿粡?fù)制叉上的兩條鏈。五、原核生物DNA的復(fù)制過程（一）復(fù)制的起始這是復(fù)制中較復(fù)雜的環(huán)節(jié)，參與因子較多，是把DNA解成單鏈和生成引物。E.coli復(fù)制始于單個(gè)位點(diǎn)（iC），有245bp的序列，一般含兩個(gè)反向重復(fù)單位和三個(gè)串

10、聯(lián)重復(fù)單位。解鏈?zhǔn)且环N高速的反向旋轉(zhuǎn)，其下游勢(shì)必發(fā)生打結(jié)現(xiàn)象。拓?fù)涿竿ㄟ^切斷、旋轉(zhuǎn)和再連接作用，實(shí)現(xiàn)DNA超螺旋的轉(zhuǎn)型，正超螺旋變負(fù)超；DnaA蛋白辯認(rèn)并結(jié)合iC重復(fù)序列的位點(diǎn)，解鏈酶（DnaB蛋白，rep蛋白）解開雙鏈（DnaC蛋白協(xié)助解鏈）；SSB和引發(fā)酶進(jìn)入，生成的引發(fā)體到達(dá)適當(dāng)位置就可按模板催化NTP的聚合，生成引物，這標(biāo)示復(fù)制起始的完成。后隨鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)復(fù)制的，引發(fā)體需多次生成。（二）復(fù)制的延長(zhǎng)DNApolⅢ在引物的3′OH端，

11、按模板堿基序，催化加入的dNTPs生成磷酸二酯鍵，子鏈的延長(zhǎng)按5′→3′方向延伸，其速度相當(dāng)快。E.coli基因組，即全套基因染色體上的DNA約3000kb。按20分鐘繁殖一代，每秒加入的核苷酸數(shù)達(dá)2500bp。隨從鏈先是生成若干短的岡崎片段，片段之間的連接由RNA酶水解去掉引物，留下的空缺（gap）由DNApolＩ催化填補(bǔ)，再由DNA連接酶將兩個(gè)片段連在一起。（三）復(fù)制的終止一般說來，復(fù)制的終止不需要特定的信號(hào)，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)的酶。E.c

12、oli環(huán)狀DNA是雙向復(fù)制，起始點(diǎn)和終點(diǎn)剛好把環(huán)分為兩個(gè)半圓，兩個(gè)方向各進(jìn)行180度，復(fù)制至最后的3′OH末端，可延長(zhǎng)填補(bǔ)起始復(fù)制時(shí)形成的引物所留下的缺口。六、真核生物DNA的復(fù)制真核生物基因組比原核生物大得多，其染色體以核小體為結(jié)構(gòu)單位組成，因此DNA的復(fù)制過程相當(dāng)復(fù)雜。其特點(diǎn)：1.有多個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，可分段復(fù)制。一個(gè)復(fù)制叉的移動(dòng)速度雖比原核生物慢，且不連續(xù)，但利用多個(gè)復(fù)制原點(diǎn)可加速?gòu)?fù)制，所以總的復(fù)制速度還是快的。2.真核生物DNA聚合酶