ICR小鼠胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)及電融合法制作小鼠四倍體胚胎.pdf

1、本論文的實(shí)驗(yàn)是圍繞"ICR小鼠胚胎干細(xì)胞的建系"工作開展的，我對以下三項(xiàng)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行了不同程度的探索：飼養(yǎng)層細(xì)胞的分離培養(yǎng)及凍存；飼養(yǎng)層制備條件的篩選及ICR小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分離培養(yǎng)；胚胎干細(xì)胞與四倍體囊胚互補(bǔ)制作嵌合體小鼠。摸索電融合法制作四倍體胚胎條件。 采用刮取結(jié)合酶消化法進(jìn)行綿羊輸卵管上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)，采用機(jī)械結(jié)合酶消化法進(jìn)行昆明白小鼠分離胎兒成纖維細(xì)胞。二者均采用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO2，1

2、00％濕度條件進(jìn)行體外培養(yǎng)。結(jié)果表明12.5d和13.5d的昆明小鼠胎兒適合胎兒成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)；冷凍盒法冷凍昆明白小鼠胎兒成纖維細(xì)胞耗時短，解凍后細(xì)胞活率高(92.1％)，比常規(guī)人工梯度降溫法冷凍效果好。 采用3.5d的囊胚進(jìn)行內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離，絲裂霉素C處理昆明白小鼠胎兒成纖維細(xì)胞制備飼養(yǎng)層，采用FBS干細(xì)胞培養(yǎng)液和SR干細(xì)胞培養(yǎng)液換液生長方式培養(yǎng)，經(jīng)過20天傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞團(tuán)集落冷凍保存。結(jié)論表明絲裂霉素C終濃度為10μg/

3、ml的DMEM培養(yǎng)液處理2h可以制備飼養(yǎng)層。 用昆明小鼠2-細(xì)胞為材料，研究電融合液中鈣離子濃度及電場強(qiáng)度對電融合法制作四倍體胚胎效率的影響。結(jié)果Ca<'2+>濃度1.0mmol/L組融合率最高(91.18±3.32％)，與其他八組濃度差異均為顯著(p<0.05)，與0.05mmol/L(50.86±4.04％)，0.1mmol/L(64.29±2.29％)，1.2mmol/L(60.71±7.91％)和1.4mmol/L(67

4、.24±5.54％)處理組差異極顯著(P<0.01)；囊胚發(fā)育率1.0mmol/L組最高(70.57±4.09％)，與對照組(67.21±4.87％)差異不顯著(P<0.05)；800 V/cm組融合率最高(97.03±0.93％)，但與600V/cm(86.35±0.79％)處理組和1000V/cm處理組(80.23±0.87％)差異不顯著(P<0.05)，囊胚發(fā)育率800 V/cm組最高(60.20±0.51％)，顯著高于1400V