spe-hplc實(shí)驗(yàn)講義

1、固相萃取固相萃取高效液相色譜法測(cè)定水溶液中的腺嘌呤核苷高效液相色譜法測(cè)定水溶液中的腺嘌呤核苷【實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.掌握固相萃取前處理樣品的基本步驟及方法2.熟悉高效液相色譜儀的一般使用方法【實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理】固相萃?。⊿PE）分離是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，使其與樣品的基體或干擾化合物分離，然后再用適當(dāng)?shù)娜軇┫闯s質(zhì)，最后用適當(dāng)溶劑洗脫目標(biāo)化合物從而達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的。腺嘌呤核苷是生物細(xì)胞維持生命活動(dòng)的基

2、本組成元素之一，參與DNA的代謝過程在體內(nèi)許多系統(tǒng)和組織有著廣泛的生理學(xué)作用，具有抗腫瘤、抗病毒、基因治療等多種生物活性。本實(shí)驗(yàn)利用固相萃取—高效液相色譜的方法，實(shí)現(xiàn)了水溶液中的腺嘌呤核苷與其結(jié)構(gòu)類相似物2’脫氧鳥嘌呤核苷，鳥嘌呤核苷，胞7嘧啶核苷，尿嘧啶核苷，胸腺嘧啶核苷的定量分離。當(dāng)樣品雜質(zhì)雜質(zhì)的極性＞目的極性＞目標(biāo)物的極性，用反相模式。采用固相萃取物的極性，用反相模式。采用固相萃取C18柱。柱。洗脫洗脫劑的選擇選擇，洗，洗雜質(zhì)雜質(zhì)

3、、目、目標(biāo)物時(shí)極性相似。目極性相似。目標(biāo)物與物與雜質(zhì)雜質(zhì)同時(shí)吸附，而吸附，而樣品中品中雜質(zhì)雜質(zhì)的極性＞目極性＞目標(biāo)物的極性物的極性時(shí)，先用極性大的溶，先用極性大的溶劑，將，將雜質(zhì)雜質(zhì)洗下來(lái)（洗下來(lái)（15％甲醇），再用極性小的溶％甲醇），再用極性小的溶劑洗脫目洗脫目標(biāo)物（物（50％甲醇）。％甲醇）。必須活化，才能與溶活化，才能與溶質(zhì)產(chǎn)質(zhì)產(chǎn)生重生重線性。先用性。先用強(qiáng)溶劑預(yù)劑預(yù)洗，以消除小柱上在生洗，以消除小柱上在生產(chǎn)或儲(chǔ)存過程中可能中可能

4、帶入的入的污染物，避免在色染物，避免在色譜圖譜圖上出上出現(xiàn)與樣品無(wú)關(guān)得品無(wú)關(guān)得雜質(zhì)雜質(zhì)峰。反相峰。反相選甲醇。甲醇。然后再用然后再用較弱的甲醇－水，洗脫弱的甲醇－水，洗脫潤(rùn)濕小柱，從而保濕小柱，從而保證樣證樣品在柱上有足品在柱上有足夠的保留與回收率。的保留與回收率。潤(rùn)濕能打濕能打開卷曲在硅膠表面上的開卷曲在硅膠表面上的烷基鏈，使溶，使溶質(zhì)與鍵合相之合相之間充分接觸。充分接觸。上樣溶劑：水；淋洗：：水；淋洗：5～10弱溶弱溶劑（水－（水－

5、緩沖液或甲醇－水）；洗脫沖液或甲醇－水）；洗脫劑：溶：溶劑強(qiáng)劑強(qiáng)度＞上度＞上樣溶劑，用小體，用小體積洗目洗目標(biāo)產(chǎn)標(biāo)產(chǎn)物。物。分別接洗脫后溶液，接洗脫后溶液，進(jìn)色譜C18柱，極性小的后出柱。柱，極性小的后出柱。【儀器和試劑儀器和試劑】高效液相色譜儀；ODS色譜柱；固相萃取儀；C18固相萃取柱；腺嘌呤核苷（A），2’脫氧鳥嘌呤核苷（2’dG），鳥嘌呤核苷（G），胞嘧啶核苷（C），尿嘧啶核苷(U)，胸腺嘧啶核苷(T)，甲醇，混合磷酸鹽緩沖液等

6、。Cy=5386.4x346.920.9992Ty=7058.9x44.4060.9997Uy=7310.8x274.2816.2樣品濃度計(jì)算樣品濃度計(jì)算各樣品濃度（μML）CU2’dGTA上樣0.3224淋洗18.3613.9810.51洗脫1.9752.7755.124Total18.3623.5719.564.5798.455【注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)】1.在活化及萃取過程中，不要讓萃取柱變干，柱床始終保持濕潤(rùn)。2.固相萃取上樣時(shí)速度不宜

7、過快，防止待測(cè)組分來(lái)不及與填料充分作用就從通道流失。3.固相萃取柱最好只用一次。因?yàn)閺膰?yán)格的意義上來(lái)說(shuō)，很多物質(zhì)的吸附是不可逆的，一次吸附，無(wú)法洗脫，若重復(fù)使用，可能影響下一次吸附。4.高效液相色譜在進(jìn)樣時(shí)，為保證進(jìn)樣準(zhǔn)確，進(jìn)樣時(shí)必須多取一些溶液，使溶液完全充滿進(jìn)樣環(huán)。【思考題思考題】1.本實(shí)驗(yàn)依次用10mL甲醇及10mL的純凈水流過淋洗固相萃取小柱，上樣后又依次用15%甲醇、純甲醇流過小柱，請(qǐng)解釋各溶劑的作用。用強(qiáng)溶劑10mL甲醇預(yù)洗