空氣懸浮顆粒物暴露對(duì)大鼠肺臟病理與病理生理學(xué)的影響.pdf

1、【研究背景】
　　近年來，慢阻肺的患病率及病死率呈繼續(xù)增長趨勢，空氣污染對(duì)慢阻肺的影響受到廣泛關(guān)注。普遍認(rèn)為，PM（particulate matter,PM）是空氣污染物中導(dǎo)致呼吸道疾病發(fā)生或加重的主要成分。生物燃料（biomass fuel,BMF）仍是大部分農(nóng)村家庭的主要能源，機(jī)動(dòng)車尾氣(motor vehicle exhaust,MVE)的釋放則是大氣中的細(xì)顆粒物的首要來源，這兩種污染源來源的PM在慢阻肺發(fā)病中的作用已成為

2、研究熱點(diǎn)，且不同來源的PM所產(chǎn)生的健康危害效應(yīng)的特征可能存在差異。BMF和MVE所形成的PM導(dǎo)致COPD發(fā)病的機(jī)制尚不清楚，研究目前仍停留在流行病學(xué)研究層面和細(xì)胞水平上，缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究PM在COPD發(fā)病中的作用。本實(shí)驗(yàn)將模擬BMF和MVE暴露環(huán)境建立特定來源PM暴露系統(tǒng)，研究兩種不同來源顆粒物暴露致大鼠肺組織病理和病理生理學(xué)改變的特點(diǎn)。
　　【研究目的】
　　研究暴露于生物燃料煙霧和機(jī)動(dòng)車尾氣環(huán)境下大鼠肺組織病理形態(tài)和肺功

3、能的改變特點(diǎn)，并觀察炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）等相關(guān)指標(biāo)的變化，分析兩種不同來源的PM作用效果的異同及導(dǎo)致COPD發(fā)生的可能機(jī)制，從而尋找新的治療靶點(diǎn)和途徑。
　　【研究方法】
　　共96只雌性SD大鼠（體重180—200 g,6—8周齡），隨機(jī)分成清潔空氣對(duì)照組（CON），生物燃料PM暴露組（BMF），機(jī)動(dòng)車尾氣PM暴露組（MVE

4、），每組32只。研究采用全身式PM暴露方式，分別構(gòu)建3個(gè)3.3m×2.2m×2.2m的房間作為暴露室。以杉樹鋸末（40g/次）為燃料燜燒產(chǎn)生PM，將BMF組大鼠置于暴露室內(nèi)，暴露 l小時(shí)/次，4次/天，5天/周；以摩托車排放的尾氣構(gòu)建交通相關(guān)大氣污染環(huán)境，摩托車處于怠速狀態(tài)排放尾氣，將MVE組大鼠置于暴露室內(nèi)，暴露2小時(shí)/次，2次/天，5天/周；CON組大鼠暴露于清潔空氣環(huán)境中，三組大鼠持續(xù)暴露1、3、5、7個(gè)月。暴露期間實(shí)時(shí)監(jiān)測暴露室

5、中相關(guān)氣體及PM10、PM2.5、PM1含量，在暴露第1、3、5、7個(gè)月時(shí)，分批處死動(dòng)物，留取動(dòng)物肺組織，外周血，肺泡灌洗液等標(biāo)本。
　　記錄大鼠體重，精神，飲食，毛色，呼吸道癥狀等一般狀況；采用HE染色觀察肺組織病理形態(tài)改變，包括肺部炎癥、氣道壁厚度，杯狀細(xì)胞化生及肺氣腫等；肺泡灌洗液（BALF）行白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)；采用高通量液態(tài)芯片技術(shù)檢測肺泡灌洗液和血清中IL-1、IL-6、IFN-γ、TNF-a、MIP-1等

6、24種炎癥因子的表達(dá)情況；以 AB-PAS染色和免疫組化染色檢測大鼠氣道粘液分泌情況；免疫組化染色半定量分析小氣道平滑肌厚度；Masson染色測定大鼠小氣道管壁膠原含量；應(yīng)用免疫熒光染色法和 ELISA法檢測小氣道管壁及血清中EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)情況；利用 TUNEL檢測肺泡上皮細(xì)胞的凋亡情況；采用Western blot方法檢測肺組織 MMP2、MMP9表達(dá)水平；使用小動(dòng)物肺功能儀(BUXCO Forced Maneuver Syst

7、em)系統(tǒng)對(duì)肺功能參數(shù)自動(dòng)分析檢測。
　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
　　1、PM暴露對(duì)大鼠一般狀況的影響
　　與CON組比較，大鼠暴露于BMF和MVE3個(gè)月后，出現(xiàn)不同程度的體重增長緩慢、倦臥、食量減少、毛發(fā)干枯和無光澤等改變。暴露6個(gè)月時(shí)，PM暴露組出現(xiàn)體重減輕、全身毛發(fā)明顯脫落，皮膚裸露。BMF組的毛發(fā)脫落較MVE組明顯，MVE組的體重減輕較BMF組顯著。MVE環(huán)境暴露時(shí)，部分大鼠1個(gè)月時(shí)出現(xiàn)喘鳴音。
　　2、PM暴露引

8、起大鼠肺部及系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)
　　HE染色結(jié)果提示，PM暴露1個(gè)月后，與CON組比較，MVE組氣道、肺實(shí)質(zhì)及肺血管均可見大量炎癥細(xì)胞浸潤， BMF暴露組炎癥反應(yīng)相對(duì)較輕。隨著暴露時(shí)間的延長，MVE組肺部炎癥持續(xù)存在，BMF組逐漸出現(xiàn)類似于 MVE組的病變，到5個(gè)月時(shí)炎癥改變達(dá)到高峰；兩組大鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)升高，以巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主，暴露7個(gè)月時(shí)更為顯著，與CON組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　采用高通量液

9、態(tài)芯片技術(shù)檢測暴露1、3、5、7個(gè)月后大鼠肺泡灌洗液和血清中炎癥因子含量，結(jié)果顯示，暴露于PM環(huán)境下大鼠血清和肺泡灌洗液總體炎癥水平均明顯高于對(duì)照大鼠。肺泡灌洗液中顯著升高的炎癥介質(zhì)包括 TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-17、IL-1α、MIP-1α、MIP-3α、IL-1β, RANTES；血清中顯著升高的炎癥介質(zhì)包括TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-17、IL-1α、MCP-1。
　　3、PM暴露對(duì)大鼠氣道結(jié)構(gòu)的

10、影響
　　PM暴露3個(gè)月后，大鼠的肺組織呈現(xiàn)氣道重構(gòu)病理學(xué)形態(tài)改變。HE染色結(jié)果提示，小氣道（選取橫切、管壁基底膜周長<2000μm的氣道作為小氣道）管壁增厚，杯狀上皮細(xì)胞及粘膜下腺體增生、肥大；AB-PAS染色和免疫組化提示大鼠氣道粘蛋白分泌增加；α-SMA免疫組化染色示氣道平滑肌增厚；Masson染色顯示大鼠氣道管壁膠原蛋白沉積開始增多。PM暴露7個(gè)月后，病變進(jìn)一步加重。與對(duì)照組比較，BMF組和MVE組明顯存在氣道管壁厚度增厚

11、、氣道粘蛋白分泌增加、氣道平滑肌增厚及管壁膠原蛋白增多，較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)PM暴露7個(gè)月后，大鼠氣道管壁成纖維細(xì)胞增多；上皮組織層局部可見上皮標(biāo)志物E-cadherin缺失，同時(shí)可見到少量間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（vimentin、FSP1）陽性著色的細(xì)胞；氣道管壁上皮下可見到少量E-cadherin+FSP1和E-cadherin+ vimentin共染色陽性細(xì)胞；采用ELISA法檢測血清TGF-β1水平顯示

12、大鼠血清中TGF-β1含量在BMF組、MVE組中均明顯升高，較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些現(xiàn)象提示氣道上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）可能參與了BMF和MVE暴露導(dǎo)致的氣道結(jié)構(gòu)重塑。
　　4、PM暴露促進(jìn)大鼠肺氣腫的形成
　　HE染色結(jié)果提示，PM暴露5個(gè)月后，大鼠的肺組織出現(xiàn)肺實(shí)質(zhì)破壞，肺泡腔增大。煙霧暴露7個(gè)月后，病變進(jìn)一步加重。與對(duì)照組比較，平均肺泡間隔在BMF組、MVE組明顯增大；利用TUNEL檢測肺泡上皮的細(xì)胞凋亡情況，

13、結(jié)果顯示暴露組的肺泡上皮細(xì)胞凋亡水平較對(duì)照組明顯增高。Western blot方法檢測肺組織中MMP2、MMP9表達(dá)情況，結(jié)果顯示PM暴露7個(gè)月后，BMF組、MVE組中MMP2、MMP9表達(dá)均明顯增多，結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5、PM暴露導(dǎo)致大鼠肺功能損害
　　PM暴露7個(gè)月后，肺功能檢查（Pulmonary function test，PFT）結(jié)果提示，暴露于PM環(huán)境下大鼠FEV(20)/FVC較之對(duì)照組明顯下降，F(xiàn)RC