微生物的保存技術(shù)

1、第14章微生物的保存技術(shù)工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和科學(xué)研究的需要促進(jìn)了微生物保存技術(shù)的發(fā)展。例如，當(dāng)發(fā)現(xiàn)微生物就是某些傳染性疾病的特殊病原時(shí)，為發(fā)展疫苗、抗生素和化學(xué)藥品，人們需要分離、鑒定和保存微生物。農(nóng)業(yè)上最明顯的例子就是對固氮菌的研究，關(guān)于工業(yè)應(yīng)用微生物的例子更是不勝枚舉。微生物發(fā)酵還提供了大量的食品、飲料和藥品。在分子生物學(xué)研究中，用先進(jìn)的DNA重組技術(shù)可以修飾微生物（U.S.Congress1981），微生物是基因工程的基礎(chǔ)。微生物是

2、重要的生物資源，保存微生物的目的，不僅使微生物菌株以活的生命狀態(tài)保存下來，并使其遺傳性狀從分離時(shí)或從實(shí)驗(yàn)開始就一直保持不變。這也是保護(hù)微生物多樣性的重要手段，還使后人能更好地應(yīng)用先進(jìn)技術(shù)開發(fā)和運(yùn)用微生物，為人類造福。為此，世界各發(fā)達(dá)國家都設(shè)有專門的菌種保藏機(jī)構(gòu)。如美國的典型菌種保藏中心（ATCC），英國的國家典型菌種保藏所（NCTC），日本的大阪發(fā)酵研究所（IFO）等。我國也設(shè)有中國微生物菌種保藏委員會（CCCCM）。微生物的保存方法很

3、多，根據(jù)不同的微生物菌（毒）株或不同的實(shí)驗(yàn)要求，可選用不同的保存方法。這些保存方法的原理大同小異。首先要挑選典型菌種的優(yōu)良純種，再創(chuàng)造一個(gè)適合其長期休眠的環(huán)境條件，諸如低溫、干燥、缺氧、避光、缺少營養(yǎng)等，使被保存的微生物減少代謝率及繁殖和利用營養(yǎng)的比率（Halliday，Baker1985）。然而，所有減少代謝率的方法都會導(dǎo)致一定比率的活力下降。為了防止菌株的丟失，還需要開發(fā)出不僅能減少代謝率，而且能防止活力下降的方法。與保存技術(shù)有關(guān)、

4、但較為費(fèi)時(shí)的另一項(xiàng)關(guān)鍵性工作是檔案記錄（Halliday，Baker1985）。這一工作不僅包括菌種或毒株的培養(yǎng)史和診斷特征等方面的準(zhǔn)確記錄，還包括對保存物的定期復(fù)蘇和培養(yǎng)記錄，以確定其活力、驗(yàn)證其純度及基因的穩(wěn)定性。最常用的微生物保存法有凍干保存法和超低溫凍存法（Gherna1981；Halliday，Baker1985；Malik1990；Rudge1991）。這兩種方法均可保存相當(dāng)長的時(shí)期（通?？砷L達(dá)30年）。其他保存微生物的方法

5、還有：低溫保存法、傳代培養(yǎng)保存法、砂土保存法等（Gherna1981）。14.1細(xì)菌的凍干保存法14.1.1一般概念凍干是目前最常用的微生物保存技術(shù)（Day，Mclellan1995）。美國ATCC在1985年第16版《細(xì)菌、噬菌體和rDNA載體目錄冊》及1987年第17版《真菌／酵母目錄冊》中，記載有11000株細(xì)菌、噬菌體和rDNA載體及21000株真菌、酵母用凍干法保存（Gherna等本章作者：田保平，韋劍珊，俞乃勝170遺傳多樣

6、性研究的原理與方法1981；Jong等1987）。凍干法是長期保存細(xì)菌、酵母、真菌、病毒和立克次氏體的標(biāo)準(zhǔn)方法（Franks1985；Berny等1991；Smith1993；Day，Mclellan1995）：將在理想條件下生長（6）鋁制封口蓋。1413方法（1）先用清洗劑（FlowLabaties，Thame，Oxfdshire，UK，7倍無磷實(shí)驗(yàn)室用清洗劑）清洗玻璃珠，然后用0.1mol／dm3HCl中和玻璃珠上的堿性，反復(fù)用自來

7、水沖洗至珠子第14章微生物的保存技術(shù)171的PH值與自來水的pH值相同為止，再用蒸餾水或去離子水清洗，最后置熱風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥。（2）用非選擇性固體培養(yǎng)基（如營養(yǎng)瓊脂或血瓊脂）在理想的條件下培養(yǎng)（一般用有螺紋蓋的20ml管裝的斜面培養(yǎng)基，將減少污染的機(jī)會）。（3）無菌條件下加2ml冷凍保護(hù)液到瓊脂斜面內(nèi)。（4）將細(xì)菌與保護(hù)液充分混勻，這時(shí)的細(xì)菌濃度為108～1010個(gè)細(xì)胞／ml。（5）將混勻后的細(xì)菌懸液移入剩余的3ml保護(hù)液內(nèi)再次混勻（操

8、作時(shí)要避免產(chǎn)生氣溶膠，尤其是操作病原菌時(shí)）。（6）吸0.5ml混勻液，加到預(yù)先標(biāo)記好的冷凍管底部，操作時(shí)要特別小心，不要使液體漏到冷凍管外壁，以免造成污染。將塞子塞入冷凍管（但不要塞緊，以便在冷凍干燥儀中抽真空）。（7）將冷凍管放入金屬半圓支架上，置入－30℃冰箱內(nèi)冷凍2小時(shí)，同時(shí)將充填物（玻璃珠，20～30粒／管）預(yù)冷至—30℃，以免將盛有冷凍管的架子移入時(shí)冷凍管內(nèi)的內(nèi)容物解凍。（8）打開凍干儀的冷凝器開關(guān)，關(guān)閉冷凝器的排水閥。當(dāng)冷凝

9、器的溫度降至－50℃時(shí)，迅速將充填裝置和冷凍管放入凍干室。然后關(guān)閉空氣閥抽真空。20分鐘后要求真空室的壓力到300Pa。要讓凍干儀運(yùn)行1～24小時(shí)，以便樣品完全干燥。（9）上述工作結(jié)束時(shí)，在真空條件下轉(zhuǎn)動螺旋起重器，以終止運(yùn)行。（10）用高頻火花檢測器（EdwardsHighVacuum）檢測冷凝管干燥器和放置期間是否維持真空環(huán)境。冷凝器內(nèi)發(fā)淺藍(lán)色或紫色光表示完全真空，深紫色或不發(fā)光表示非完全真空。（11）用鋁蓋密封冷凍管上的塞子。（1